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各种PCR的“酶”你不行!

2020-8-2| 编辑: 小桔灯网| 查看: 457| 评论: 0|来源: IVD学习笔记

摘要: 聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的核苷酸片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊核苷酸复制,PCR的最大特点是能将微量的核苷酸进行大幅扩增,从而达到容易鉴定和识别程度。各种PCR到底需要哪 ...

聚合酶链式反应PCR)是一种用于放大扩增特定的核苷酸片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊核苷酸复制,PCR的最大特点是能将微量的核苷酸进行大幅扩增,从而达到容易鉴定和识别程度。

 

各种PCR到底需要哪些种类的酶?请看中心法则,分子生物学的中心教条。体外的各种聚合酶链式反应就是中心法则的完美运用。


中心法则,以及酶的作用


DND聚合——又称DNA依赖的DNA聚合酶

它是以DNA为模板,催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶根据聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同,有可以分为多种。在IVD领域中比较常见的酶如下:

 

Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶,分子量65kD,

Thermus aquaticus中分离出来,是目前科研和分子诊断试剂盒里最为广泛应用的聚合酶。为了更优化PCR反应体系,Taq DNA 聚合酶被进行了一系列的性能提升和优化,其中最为熟知的就是热启动Taq酶,该酶被进行了化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。无论是哪种修饰,其原理都是:在反应体系加热至高温之前,Taq DNA 聚合酶活性被“修饰”抑制,进而抑制低温条件下的非特异性扩增。另外,还有一系列突变体Taq DNA聚合酶被筛选出来以满足耐镁离子、耐盐、高保真等要求。

 

Bst链置换DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是来源于 Bacillus stearothermophilusDNA Polymerase I,经基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性,但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。同时,该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高,而且增加了dUTP耐受性,非常适合于防污染的等温扩增反应,如 LAMP 等。

由于此次新冠的影响,Bst成为IVD领域内又一个DNA聚合酶宠儿

 

Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilus HB8,其最有趣的现象是:在Mg2+条件下,Tth DNA聚合酶具有较强的DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下,Tth DNA聚合酶具有更强的反转录活性。这一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相应的buffer可以同时对DNA模板和RNA模板进行扩增。

 

逆转录酶——又称为RNA依赖DNA 聚合酶

该酶以RNA为模板,按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链,这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA,CDNA)。最常用的逆转录酶为M-MLV和AMV。

 

RNA聚合酶——一条DNA链或RNA为模板的聚合酶

也称为转录酶。最为常见的是T7 RNA聚合酶,分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中, SAT技术中会看到RNA 聚合酶的身影。




实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing,简称SAT)是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。该技术具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。同温度下,首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸(RNA)的一个双链DNA拷贝,然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(100~1000个)RNA拷贝;每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环;同时,带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合,产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获,实时反映扩增循环情况。

  

蛋白酶K——能够酶解样本中的各类蛋白质的酶

蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶,具有很高的比活性,在较广的pH范围(4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)下均有活性,EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNARNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中,蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一,蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活,同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。


当然,除了以上提及的酶以外,还有其他各种各样的酶被广泛应用。欢迎大家来讨论。

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