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mNGS规则及应用---宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)

2020-7-26| 编辑: 小桔灯网| 查看: 566| 评论: 0|来源: 达瑞病原微生物

摘要: mNGS规则及应用继2019年版的《宏基因组测序在临床重症感染患者寻找病原体中的应用》后,2020年《宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)》出版,今天小编和大家一起品品mNGS解读规则。1不同病 ...



mNGS规则及应用



继2019年版的《宏基因组测序在临床重症感染患者寻找病原体中的应用》后,2020年《宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)》出版,今天小编和大家一起品品mNGS解读规则。
1
不同病原体检测方法的特点

  临床样本中病原体检测方法有很多,包括:


鉴定培养物中生长的微生物。


通过血清学实验检测特定微生物的生物标志物

[如通过乳胶凝集进行抗原检测或通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行抗体检测]。

通过分子生物学实验进行单个或多重病原体特异核酸检测。

这些方法虽然多,并且可以组合应用,对于常见高发感染也非常有效,但是它们都属于试错型,高度依赖于临床医生的判断选择

目前在重症感染病例的诊断上,试错型尝试病原体检测耗时较长,临床总体阳性率也比较低。临床mNGS的技术特点是能够大范围甚至是全方位试错,为临床医生提供了一个快速的检测手段。但目前由于新技术的成本较高,且mNGS与宏转录组学测序( mtNGS)存在差异,导至临床敏感度与预期相对较低,简单地增加成本投人能有效提高临床敏感度。此外,临床mNGS除了测序生化反应外,还包含了病原体数据库自动分析比对专家系统,对于检测结果的准确性也非常重要,故不是一个简单的测序反应。一线工作人员,尤其是从事重症病例治疗的医生,需要对mNGS的临床应用有更多的了解,才能使mNGS更好地服务于临床。



2
mNGS报告解读规则

mNGS报告通过测序短序列的数量(reads)进行物种的鉴定,碱基序列片段数量越大,表明该物种在样本中存在的可能性越高,但需要区分不同物种。同时需要考虑基因组的覆盖度,覆盖度与可信度呈正相关,但并非呈线性正相关。具体参考2019年的专家指南中mNGS检测的专有名词解释。



阴性结果的解读:

mNGS报告中的信息是经过特定阈值过滤后的结果,如果是阴性报告,首先需要分析患者的具体情况,再研究除报告外的原始检测结果,判断是因为未达到阈值误判,还是确实不存在病原体。可以根据具体的临床信息,在报告阈值之外考虑可能的原始检出感染病原体,如胞内感染菌。在阴性结果中,如果没有进行RNA的宏基因组检测(也称为mtNGS),可能遗漏了以RNA为遗传物质的病毒,需进一步检测宏转录组以明确病原体,如一种新型病毒性脑炎RNA病毒的发现,否则存在假阴性的可能。对于某个临床样本,mNGS和mtNGS都为阴性的情况下,且内参检测值提示该样本中单位体积内(通常为1 mL)已知最小病毒小于10个分子时,可以考虑阴性价值,即患者不存在感染性疾病,可能存在免疫性疾病和肿瘤等


阳性结果的解读:

因不同部位临床样本的背景微生物存在差异,故阳性的判读需要建立阈值才可以将真阳性的病原体从背景微生物中分离出来。这些阈值可以包含一些指标,如检出特定微生物序列的数量、归一化为每百万序列的相对值、检出微生物的基因组覆盖度及内参对照的检出等情况。但需要在相同的测序平台、相同的实验室进行比较,以排除平台和环境差异带来的影响。而当某个鉴定达到阳性判断阈值后,其增量与可靠性呈正相关,但并不呈线性相关,在未达到阈值时,其增量与鉴定可靠性呈指数正相关。因此,在判断阳性时,达到阈值即可信。此外,在阳性报告中,如果有多种微生物大量存在,则应结合定植微生物考虑假阳性物种。而针对一些常见病原体,需考虑并增加耐药基因的检测,以提供更多的临床治疗指导方案。这里为常见的21种的病原体和32种抗生素。



常见微生物检测结果与临床检测结果不一致,且不能排除感染时,应作为怀疑的依据,再次送高通量检测;如果高通量检测的对应病原体序列升高,则提示有非常见的微生物,与临床信息吻合,应选择靶向抗感染治疗

非体内正常定植菌的外来侵入性微生物在非感染部位出现,一旦被检出,即认为是病原体。


对于区别背景微生物、病毒以及快速分裂期的微生物,mRNA的诊断价值有待进一步临床观察与研究加以证实。如果相应mRNA序列数增加,则提示可能存在DNA病毒快速繁殖,要与病毒RNA进行鉴别。

延迟阳性:有一些病原体由于被吞噬细胞吞噬,经一段时间裂解释放核酸后才能被检出,需考虑多次送检。


物种差异判读:不同的病原体类型对应的阈值不同,应分类解读。


病毒:

一些显著区别于人基因组序列的病毒,如腺病毒和流感病毒等,有少量的特异序列检出即可信,其阈值通常在3/100万及以上即为可信;而一些与人源序列相似度高的病毒,如反转录病毒类,在检出序列较少时,因无法判断是否来自一些转录元件,只有更多序列检出时才可信,其阈值通常需要超过1000/100万,因为哪怕确实是某类反转录病毒,相对较少的检出序列也更多指向其在人体内是潜伏状态,而不是感染状态。


真菌:

真菌的基因组较大,并且存在较厚的细胞壁,因此在核酸提取的效率上会大打折扣,即使进行了一些破壁处理,其检出的特异序列数仍然不会很多,因此对于真菌的鉴定,其阈值考虑在5/100万以上,在达到100/100万以前,其可信度随序列数增加而增加。


细菌:

对于一些细菌来说,要着重区分是定植菌、污染还是真正的病原菌。对于非胞内感染菌,因不同细菌间存在同源相似性,菌种间可信阈值差异较大,并且因不同实验室而有差异,因此鉴定报告应给出具体菌种的阳性参考阈值,并列出背景菌作为参考;而对于胞内感染菌,如结核分枝杆菌和军团菌的阈值相对较低,通常有1/100万即可考虑可信,随着序列数增加,其可信度逐渐增加,但达到30/100万时,其增量不再有增加可信度的意义。


寄生虫:

因为目前寄生虫的基因组参考数据库种类不多,且寄生虫生物的多样性,作为真核生物,有很多与人基因组相似的元件,因此在判断阳性时要特别要求序列的特异性(唯一比对)。寄生虫作为阳性判断的阈值需在10/100万以上,并且需要严格确认序列的特异性。



罕见病原体的阳性价值:

罕见病原体在报告中出现时,需要进一步确定其致病性及临床特征,包括感染病灶的影像。罕见病原体的确认需要进一步调查患者病史,以确定其为动物疫源或者环境疫源的流行病学证据。



污染与定植:

在mNGS报告中,需要考虑取样和样本处理等环节带来污染的可能性。例如:呼吸道肺泡灌洗液的样本报告有大量的口腔菌,首先考虑取样是否存在污染,其次考虑由于特殊原因造成的感染。但是如果存在非常多的背景微生物或者杂菌,且没有1种或者几种病原体占有主导量的优势,可以间接考虑患者免疫状态严重破坏,需要引起治疗和护理上的重视



参考文献:

李颖,麻锦敏.宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)[J].中华危重病急救医学,2020,32(05):531-536.

林东旭.宏基因组测序在临床重症感染患者寻找病原体中的应用[J].临床医药文献电子杂志,2019,6(93):161.
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