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关于测序的那些事

2020-5-26 18:49| 编辑: 班木芙兰| 查看: 3310| 评论: 0|来源: 生物谷

摘要: 我们常说的基因一般是指DNA,因此基因测序也被称为DNA测序,通俗讲,就是获得我们的目标DNA片段中的碱基(ATGC)排列顺序。今天我们就聊聊关于测序的那些事。世界上第一台测序仪是1977年Walter Gilbert和Frederick S ...



我们常说的基因一般是指DNA,因此基因测序也被称为DNA测序,通俗讲,就是获得我们的目标DNA片段中的碱基(ATGC)排列顺序。今天我们就聊聊关于测序的那些事。
 


世界上第一台测序仪是1977年Walter Gilbert和Frederick Sanger发明的,测序原理方法就是我们常说的Sanger测序法。同年,Sanger应用该测序仪测定了第一个基因组序列,噬菌体X174,长5375个碱基。标志着第一代测序技术的诞生。
 
第一代测序技术时至今日依然被广泛使用,并作为测序技术的“金标准”,其最重要的优势在于读长相对较长,可达1000bp,且准确性极高高达99.999%。但其劣势也十分明显,那就是通量低,一次只能测一条DNA序列,根本无法满足现在科学发展。
 


2005年,二代测序技术孕育而生,其打破了一代测序的一次测定一条序列的限制,其能在同一时间对几十万至上百万条核酸序列进行测定,大大提高了测序通量,因此也被称为新一代测序技术。提起二代测序不得不说下二代测序中的曾经的三巨头(罗氏454,Illumina Solexa,ABI SOLiD)以及国内的后来者华大基因。
 
2005年,454公司(后被罗氏收购)推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System,标志着二代测序技术由此诞生。但随着其他二代测序技术的出现,454技术虽然在读长(最长可以到1000bp)与准确度上有较好的表现,却因为其成本高昂,市场接受度不高,导至罗氏公司在后期逐步关闭了454生命科学测序业务。
 
454的测序原理是边合成边测序中的单碱基添加(SNA)法,其对参与测序的碱基进行标记,每次反应都只允许进入一种碱基,当有一个碱基连入DNA链,就会产生一个生物荧光信号,通过相机就能捕获到信号。这样要是单碱基重复就会继续读取。
 
2006年,Solexa公司也推出了自己的NGS系统——Genome Analyzer,简称GA。2007年,Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa,并将其商品化。其核心原理是基于边合成边测序,其中包含了DNA簇(DNA cluster)、桥式PCR(Bridge PCR)和可逆阻断(Reversible terminator)等核心技术,具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。
 
在二代测序技术出现之前,ABI公司一直处于测序行业的垄断地位,2005年454公司的推出了FLX焦磷酸测序平台后,ABI公司迅速做出反应,收购了Agencourt Personal Genomics,并在于2007年推出了SOLiD 新一代测序平台。基于连接的测序原理,简单来说,就是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接,发出不同的荧光信号,从而读取目标序列的碱基排列顺序,因此方法会使用探针进行2次测序,故为其在以上几种测序手段中,准确性是最高的。但后续SOLiD系统通量难以提升,且读长短、成本高,也逐渐退出历史舞台。
 
2013年3月18日,华大基因宣布对Complete Genomics进行全额收购。2015年,在第十届国际基因组学大会(ICG-10)上,华大基因正式发布了自主研发的新型桌面化测序系统BGISEQ-500。历时2年,华大自主开发了DNA纳米球技术(DNB),组合探针锚定连接(cPAL)等一系列核心测序技术,其测序原理利用四种不同颜色标记的探针去读取接头附近的碱基,探针能够与DNA片段结合,T4 DNA连接酶连接探针和anchor,使探针稳定结合,从该探针携带的荧光基团的颜色来判断该位置是何种碱基。当一轮反应结束后,去除anchor-prob产物,重复上一轮步骤测序下一个碱基。
 
时至今日,二代测序方法已不仅仅是上面所写的这些,还有Qiagen公司的GeneReader、Life Technologies 公司的Ion Proton(如今被Thermo Fisher收购)等。而且第三代测序单分子实时测序也已应用到我们的科学研究中,其中主要代表是Pacific BioScience和Oxford Nanopore。与前两代测序技术相比,其最大的特点就是无需PCR,是对单个核酸链直接进行测序,并且理论上可以测定无限长度的核酸序列
 
PacBio技术平台利用了一种带有很多零波纳米孔(ZMW)的厚度为100nm的金属片,每个ZWM孔有且仅能允许一条DNA模板进入。测序时,所需的DNA聚合酶被固定在ZMW孔底,待测序列和不同荧光标记的dNTP进入后,每当一个dNTP被添加到合成链上的同时,ZMW孔的荧光信号检测区就能检测到该荧光,根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类,从而获得核酸的碱基序列信息。
 
Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术最大的亮点在其检测技术是基于电信号,而不是光信号。他们设计了一种特殊的纳米孔,每个纳米孔会结合一个核酸外切酶,孔内共价结合有分子接头。当DNA模板进入孔道时,孔道中的核酸外切酶会紧紧的与DNA分子结合,并顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基,每通过一个碱基,就会产生一个阻断,每碱基的阻断电流是不一样的,通过阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类,最终得出DNA分子的序列。


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