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行业|基于基因编辑的新冠病毒试剂盒正式获批上市!快来看看CRISPR这把神奇的剪刀手!

2020-5-24 01:24| 编辑: 小桔灯网| 查看: 2894| 评论: 0|来源: 思宇医械观察丨作者:刘玲玉

摘要: 前言时至今日,很多研究者仍着迷于研究细菌CRISPR系统的功能,以及如何借助对相关机制的理解来产生新的技术。CRISPR系统目前在临床诊断与基因疗法中的研究成果也在不断涌出。近日,Sherlock Biosciences公司宣布其基 ...



前言


时至今日,很多研究者仍着迷于研究细菌CRISPR系统的功能,以及如何借助对相关机制的理解来产生新的技术。CRISPR系统目前在临床诊断与基因疗法中的研究成果也在不断涌出。近日,Sherlock Biosciences公司宣布其基于CRISPR技术的新冠病毒试剂盒已获得美国FDA的紧急使用授权。这是FDA首次批准基于CRISPR基因编辑技术的新冠病毒检测产品,也是首次授权使用CRISPR技术进行传染病检测。

 

一、CRISPR-Cas是细菌体内精妙的防护系统

 

CRISPR的全名是“规则间隔簇状的短回文重复序列”,最初在研究者细菌和古细菌的DNA中发现了这些序列,大小范围为23-47个碱基对。这些重复序列(repeat)被相似长度的间隔子(spacer)隔开。

      


Repeat是细菌固有序列,能够同时结合CRISPR相关性(Cas)蛋白和spacer序列,而spacer则是细菌(或是其祖先)感染过的病毒序列。一旦病毒感染发生,绝大多数的细菌死亡,极少部分的细菌由于其基因变异得以生存。这些细菌中的一部分,将病毒的DNA序列切割后,插入repeat区域中,形成spacer,从而获得类似高等生物“免疫记忆”的能力。当细菌被病毒再次攻击时,这些间隔序列会从整个序列排列中被转录出来,切割成为成熟的crRNA对Cas蛋白的复合物进行引导,切割病毒的核酸分子中的间隔序列前体(protospacer)。

 

crRNA招募效应蛋白的组成将其分为两级,1级CRISPR系统利用多个Cas蛋白与crRNA形成效应复合物,2级CRISPR系统利用单个大Cas蛋白与crRNA形成效应复合物。

 


需要注意的是,只有当间隔序列前体的两侧是由间隔序列前体临近基序(PAM)组成时才会发生切割,而在间隔序列两侧没有PAMs时不会发生。不同的Cas蛋白识别不同的PAM序列,有研究表明产脓型链球菌(Streptococcuspyogenes)中的SpCas9对病毒基因组的切割作用需要在病毒性序列作用目标下游有一个5'-NGG-3'间隔序列前体临近基序(PAM)序列的存在。

 

总而言之,CRISPR-Cas系统是一种RNA介导的适应性免疫系统。整个过程有点类似慕容复的“以彼之道,还施彼身”,你用DNA对付我,我用你的DNA把你杀死。


二、CRISPR-Cas临床诊断优势凸显

 

利用CRISPR酶的酶切特性,分子诊断技术有望在两个方向实现突破:一是对多种病原体实现高灵敏度定量检测;二是快速诊断,减少检测时间。Gootenberg等开发了一种改进的核酸检测技术,用于多重定量和高度灵敏的检测,并结合了侧向层析技术对核酸检测结果进行可视化。Myhrvold等通过添加样品制备方案,以快速检测临床样品中的特定病原体。

 

2016年,国内最有名的张锋实验室团队发现Cas13在单个crRNA的引导下,能够切割ssRNA或mRNA(类似于RNA干扰),实现基因敲低方面的应用。同时,Cas13还附带非特异性的ssRNA切割功能。其开发的SHERLOCK v1版方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬灭的ssRNA报告基团 ,通过等温扩增步骤来快速检测单个DNA或RNA分子。

 

2018年,张锋实验室团队的成果用简单的纸带(paper strip),以展示基因特征(genetic signatures)的测试结果。将纸带浸入处理过的样本后,会出现一条线,指示着目标分子是否被检测到了。通过对CRISPR酶学的表征和应用开发,实现了更快速、更灵敏的检测:1、检测下限低至2 attomolar;2、通过将Cas13与Csm6(一种与CRISPR相关的辅助酶)结合,使信号灵敏度提高3.5倍;3、SHERLOCK v2可以通过侧向层析检测登革热或Zika病毒单链RNA以及患者液体活检样品中的突变,突出了其作为核酸的可复用,便携式,快速和定量检测平台的潜力。

       

   

2018年4月,另一个知名团队Jennifer Doudna教授发现Cas12酶家族在gRNA的引导下与目标序列结合以后,便会切换为激活状态切割体系内其它的单链DNA(如含有报告基因的单链底物)。Cas12a这一特点可被用于分子诊断领域,实现对肿瘤基因或特定病原体的检测。Doudna教授将Cas12a靶向切割单链DNA的特性与重组聚合酶扩增RPA技术联合起。当加热到体温时,RPA会快速增加目标DNA的拷贝数,使Cas12a更容易找到并切割它,然后任意切割附近单链DNA,从而让报告分子发出荧光。

      

       

Doudna教授为了分析DETECTR方法的特异性和灵敏度,测试了25种人类肛门拭子的DNA提取物,这些样本先前已通过基于聚合酶链反应(PCR)的方法进行过HPV感染分析。在1小时内,DETECTR准确地鉴定了包含HPV类型异质混合物的患者样品中的HPV16(25/25)和HPV18(23/25),PCR结果与DETECTR荧光信号之间具有良好的相关性。这些结果证明了一种新的基于CRISPR的诊断平台,类似于使用CRISPR-Cas13a用于RNA检测的平台,并表明DETECTR原则上可以以高灵敏度和特异性检测任何DNA序列。

 

     

较为明显的是,RT-PCR的检测一般要等几个小时,还需要使用特殊设备、进行冷热循环;与之相比,DETECTR以及SHERLOCK v2技术只有两个固定的操作温度,大约45分钟后,就能像家用验孕测试一样,在可视化读出条上读取结果。具有良好的应用前景。

 

三、CRISPR与罕见基因病疗法

 

除了在临床分子诊断领域的应用,CRISPR基因编辑技术已应用于白血病、血友病等遗传病的基因疗法(gene therapy)取得多项进展。基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,达到治疗目的。目的基因转移方法可分为病毒方法和非病毒方法两大类。由于CRISPR/Cas9基因编辑技术能作为向导把目的DNA送达靶位置,避免对正常功能基因的干扰,可减少不必要的突变风险。目前这项面临的主要挑战是将它送到体内的正确位置。

 

市场上主要的专注于基因编辑的3家上市公司为Editas Medicine、 CRISPR Therapeutics和Intellia Therapeutics,多家创业公司融资到B轮。但CRISPR基因编辑的发展并非一帆风顺。2018年5月,CRISPR Therapeutics公司与Vertex Pharmaceuticals的合作遭遇挫折,其共同研发的针对镰刀型贫血症的基因疗法CTX001在FDA的IND审查中受到临床试验暂停。近日获得进展,于 5 月 11 日宣布,(FDA)授予 CTX001 再生医学高级疗法(RMAT)资格,CTX001 是基于CRISPR研发出的一种研究性,自体基因编辑的造血干细胞疗法,将用于治疗严重的严重镰刀型细胞贫血病(SCD)和输血依赖性β地中海贫血(TDT)。

       

     

主要问题是由于目前广泛用于基因组编辑的CRISPR / Cas9方法涉及切割两条DNA链,在目标DNA序列中形成双链断裂。当用于纠正单个核苷酸时,会经常在目标位置引入随机插入或缺失(统称为indels)。消息一出,3家上市公司的股价均受到严重挫折。为了解决这个问题,David Liu及其同事的研究对Cas9蛋白进行了修饰,使其不再切割两条DNA链,但仍可以与目标DNA序列结合。通过将碱基修饰酶(APOBEC1)连接到Cas9,能够将胞嘧啶(C)直接转化为尿嘧啶(U),尿嘧啶(U)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对。

 

结语


我们非常可喜地看到,CRISPR技术在临床感染诊断,液体活检和基因治疗方面都取得了不错的进展。如何能让CRISPR技术这把神奇的基因剪刀手变得准确率更高、编辑更有效,是CRISPR技术发展的主要方向。

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