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IVD产品性能评估系列丨分析特异性

2020-5-11| 编辑: 班木芙兰| 查看: 2272| 评论: 0|来源: 小桔灯网

摘要: 继介绍了推荐阅读“精密度”、“正确度”以及“分析灵敏度”以及参考值和参考区间之后,本篇文章作者主要介绍分析特异性评价试验一些相关概念、术语及试验方案。患者样品检测结果与真值间的偏离主要有三个因素,包括 ...


继介绍了推荐阅读

“精密度”、“正确度”以及“分析灵敏度”以及参考值和参考区间之后,本篇文章作者主要介绍分析特异性评价试验一些相关概念、术语及试验方案。


患者样品检测结果与真值间的偏离主要有三个因素,包括系统偏差、随机偏差和干扰。分析干扰是指在测定某分析物的浓度或活性时,受另一种非分析物影响而导至测定结果增高或降低。


在某种程度上由一个干扰物引起的未预料作用可使临床检验结果具有显著误差。


生产企业和实验室有必要在医学需要的基础上评价干扰物,告知临床已知有医学意义的误差来源。




一、概    念




分析特异性:一种分析方法检测某种成分的能力或者只对一种指定的分析反应物而不是样品中其他物质。


在《中国医药报》中分析特异性被定义为:测量程序只测量被测量物的能力。


干扰:由于另一成分的影响或样品的特性,待测的一定浓度的被分析物出现有临床意义的偏倚。


内源性干扰:样品中一些生理物质(胆红素,血红蛋白)对某些物质分析时引起的干扰。


外源性干扰:源自体外的物质(如药物、样品防腐剂或样品污染物)对某些物质分析时引起的干扰。


干扰物/干扰物质:样品中不同于分析物且能引起测试结果偏倚的组分。


基质:样品中除分析物之外的其他成分。


基质效应:基质对分析物测定结果的影响。如粘性,表面张力,pH值等。


交叉反应:在结构上和抗原相似的干扰物在免疫学方法中与抗体发生的反应。




二、干扰机制




  • 物理效应:干扰物与被分析物相似,比如荧光,颜色,光散射,洗脱位置或者是可以被探测或被测量的电极反应。


  • 化学效应:干扰物通过竞争反应物而抑制反应,或者抑制指示剂反应,也可以通过配位络合或沉淀反应而改变被分析物的形式。


  • 酶的抑制:干扰物通过隔离金属激活剂,结合到催化部位或氧化关键巯基而改变酶的活性。


  • 基质效应:干扰物改变样品基质的物理特性,比如粘度、表面张力,浊度或离子强度,引起分析物的测量结果明显改变。


  • 交叉反应:在结构上与待测物抗原相似,干扰物在反应时与抗体发生交叉反应,从而导至测量不准确。


  • 水被取代:非水融性物质(蛋白质、脂质)通过取代血浆水的容量而影响以活性测定为基础的测量方法。


  • 非特异性:干扰物以和被分析物相同的方式发生反应。



三、分析特异性试验的方案




在EP7文件中推荐了两种分析特异性评价方案,“干扰筛选方案”和“患者样品偏倚分析方案”。但每一种方案都有其优点和内在局限性,生产厂家或实验室最好能综合应用两种方案,方可较全面评估产品分析特异性能。


扰筛选方案:此方法具体分为两步


  • 第一步先进行配对差异试验,即将潜在的干扰物添加到样品中评价干扰效应,然后评价相对于未添加干扰物的对照样品的偏倚。


    根据分析物情况进行几个医学决定水平浓度处的试验,最通常的方法是在高浓度下,对一系列可能的干扰物做初步筛选;


  • 第二步剂量效应试验,用含有干扰物高浓度水平和浓度水平的两个样品,通过精确定量吸样,制成一些列不同浓度的测试样品。可以确定干扰物浓度和干扰度之间的关系的试验方法。


干扰筛选方案由于是人为加入干扰物,存在以下局限性


  • 添加到样品中的化合物的特性可能不同于在体内自然循环状态下的化合物;


  • 试验样品基质不代表典型的有问题的临床样品;


  • 样品中真实的干扰物可能不是原来的药物,而是代谢产物;


  • 实验浓度太高或太低以致不真实。


患者样品偏倚分析:


选择特定患者样品,如心脏,肾脏或肝脏疾病患者样品,含有高血脂,高胆红素或高血红蛋白的样品,用过某种可能有干扰药物的患者样品。用参考方法(或比较方法)和试验方法同时测定,将结果进行对比,以确定试验方法是否存在干扰。


此方案需要参考方法或者具有低干扰性和高特异性的比较方法,已确定在比较研究中的“真值”。


该方案试验变异缺乏控制对照,存在以下局限性:


  • 此方案只能证明偏倚和估计的干扰物质某水平的相关性,而不能证明其因果关系;


  • 患者通常服用多种药物,可能导至内源性代谢物浓度的增高,难以证实何种药物的干扰作用;


  • 干扰物可能不存在于该批患者的测试样品中;


  • 样品不新鲜,一些不稳定的组分可能丢失。


小编综合考虑我国国内十余篇检测试剂注册审查指导原则和《WS/T416-2013 干扰实验指南》,其中的法规并没有强制要求进行“患者样品偏倚分析方案”评估,而且考虑其样本获取较难,实验的可行性较低;


下面着重介绍“干扰筛选方案”的具体操作步骤,不再对“患者样品偏倚分析方案”做过多介绍。




四、干扰筛选方案步骤



 配对差异试验

图1:配对差异试验步骤


1、基础样品:从健康没有进行药物治疗的个体获得适当类型(血清,全血,尿液)的新鲜样品。


注意如果难以获得新鲜样品,可用合适的冻干或冷冻的样品代替,但需要注意的是冷冻样品中是否含有防腐剂,稳定剂或促凝剂等,这些物质也会导至干扰效应。


确定批内差:选择含一定浓度分析物且不含干扰物的样品,最好选择两个浓度,每个浓度重复检测10次,计算其均值和批内标准差。


2、根据产品特点,确定差别的标准dma;


3、根据公式计算含干扰物样品所需的重复测量次数n=

其中在z1-a\2是正太分布时双侧检验100(1-α)%的百分位值;  Z1-β\2是正太分布时100(1-β)%的百分位值;S:批内标准差;dmax是分析物在某测试浓度水平时的最大允许干扰值;


比如,生产厂家要检测可接受干扰程度为1.5mg/ml的干扰效应,95%的置信限(α=0.05)和95%的检验效能(β=0.05),批内精密度为1.0mg/ml,则代入公式

N=2[(1.96+1.645)×1.0/1.5]2=11.6≈12,即每一个测试和对照样品重复次数应为12次。


4、根据步骤③确定的重复检测数,准备试验组样品。

先将合适且纯度较高的干扰物进行溶解或稀释,可供选择的溶剂有:试剂等级的水,稀 释的HCl或NaOH,乙醇或甲醇,丙酮,二甲基亚砜(DSMO)等。


向步骤①中所述的基础样品中加入上述干扰物溶液作为对照组样品,尽可能小地稀释样品基质,最好小于5%。


5、根据步骤③确定的重复检测数,准备对照组样品。


向步骤①所述的基础样品中加入干扰物的溶剂作为对照组样品,其添加体积与试验组相同。


6、按交互顺序测试对照组和试验组样品进行测试;


7、数据分析:计算dobs和dc,其中dobs=

其中dnull为无效假设规定的值,通常为0;n为重复测试次数,s为批内标准差;


8、结果解释:当dobs≤dc时,则认为该物质引起偏倚小于 dmax,不是干扰物质;若dobs>dc时,则认为该物质引起干扰,应进行剂量效应试验,进一步确定其干扰效应。


剂量效应试验方案


剂量效应试验是确定干扰物浓度和干扰度之间的关系,干扰度是测试范围之内任何干扰物浓度的效应估计。


如果配对差异试验方案中的分析物出现干扰效应,则应通过剂量效应试验,以确定干扰物在不同浓度时的干扰度,干扰物的系列浓度应通过高值样品和对照样品混合制备。


  1. 准备高浓度干扰物样品和基础样品;

    高浓度干扰物样品:向基础样品中加入稀释好的干扰物,制备成一定浓度干扰物的样品。

  2. 制备0%,25%,50%,75%,100%高浓度待测样品;

3.在同一分析批次内测定上述5个样品,每个浓度水平重复测3次;


4.计算低浓度样品平均值,其他各组结果减去该最低浓度样品的平均值,进行回归分析;


5.结果解释:根据步骤④所进行的回归分析,可得到干扰物在不同浓度的干扰度,干扰物无论是呈现线性干扰还是非线性干扰,根据回归曲线,都可以计算出干扰物在一定浓度时对分析物检测结果的干扰程度。从而可以排除干扰物的影响,准确得到分析物的量。




五、干扰试验报告



主要包括以下内容:


  • 被评价检测系统的名称、品牌、型号、所用试剂、校准品和质控品的生产厂家及批号。


  • 被测量的名称


  • 被评价干扰物化学名称或通用名称


  • 干扰评价方案依据


  • 干扰试验中使用的样品类型及被测量浓度与干扰物浓度;


  • 表述干扰效果的相关数据或方程;


  • 描述干扰效果时,可用以下方式:列出干扰物的特定浓度,低于此浓度未观察到具临床意义的干扰;列出干扰物的特定浓度,高于此浓度可引起超过干扰标准的偏差;




六、总  结




本文依据EP7以及《WS/T416-2013 干扰实验指南》,对如何评估产品的分析特异性的方法进行了介绍。


根据小编对我国国内大部分检测试剂盒注册技术审查指导原则理解,审评中心一般将分析特异性分为两部分,一部分为交叉反应,易产生交叉反应的抗原,抗体及嗜异性抗体等的验证。


另一部分为干扰物质,样品中常见干扰物质对检测结果的影响,如高脂,黄疸,类风湿因子,抗凝剂等干扰因子的研究。如在《2019新型冠状病毒抗原抗体检测试剂注册技术审评要点》中,明确要求交叉反应要对HKU1,OC43,H1N1,等进行验证,要求干扰物质中对胆红素,血脂,血红蛋白,类风湿因子等进行验证。


但值得说明的是,由于不同厂家所用检测抗体不同,方法学不同,其对应的交叉反应的物质和干扰物也不尽相同。


目前没有一种方法可以有效的鉴别所有的干扰物,一些干扰物,如药物代谢产物在筛选实验中不能被鉴别出,而一些物质又可能被错误的划分为干扰物,如非天然后添加的物质。路漫漫其修远兮,吾将上下而求索。


因此,生产厂家和实验室的研发人员都应尽可能弄清实验方法的特异性以及干扰物质给患者样品带来的影响,除根据相关文献确定干扰物外,还应开展试验验证,评价其医学意义并设计改进方案等。



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