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聚焦 | 单细胞技术分类及应用

2019-10-28 11:13| 编辑: 面气灵| 查看: 3110| 评论: 0|来源: BerkeleyLights

摘要: 2019年10月22日,Biogen与日本Eisai宣布,经与FDA协商,计划于2020年初向FDA提交Aducanumab治疗阿尔兹海默症(AD)的上市申请。如果获批,Aducanumab将成为首个逆转疾病进展的AD药物。从技术角度看,Aducanumab也将 ...


2019年10月22日,Biogen与日本Eisai宣布,经与FDA协商,计划于2020年初向FDA提交Aducanumab治疗阿尔兹海默症(AD)的上市申请。如果获批,Aducanumab将成为首个逆转疾病进展的AD药物。从技术角度看,Aducanumab也将有可能成为首个单B细胞测序来源的抗体药物。正如Aducanumab一样,越来越多的处于研发阶段的抗体候选药物来自单细胞技术。不仅仅是药物研发,在科学研究上随着科学家对于复杂生命体和生命现象的研究日趋深入和细化,他们也不再满足于仅仅研究细胞均一群体拿到细胞之间共性的均一化数据,而是越来越重视同一细胞群体内单个细胞之间的差异性认识和理解,从而帮助我们对从宏观到微观的生物学调控过程和机制有更为精准和深刻的认识。因此可以说当前单细胞层面的研究在生命科学各个领域、各个层面都逐渐成为重要的研究模式。


单细胞研究的发展趋势

从技术角度来看,单细胞研究检测平台通常需要同时结合细胞分离技术和单细胞分泌物分析检测技术,尤其是第一步单细胞分离的操作方法因不同的研究需要而有所区别。常规对于能够确定分选所涉及的标志物以及标志物能够被直接检测的情况,一般利用流式分选技术FACS即可实现大量细胞和复杂样本的单细胞分选,并且通量较大(可做到384孔板),但是有所顾忌的是高速高压的流式分选环节对细胞活性会造成的影响以及FACS并不具备操控某个特定目标细胞或者动态跟踪观察单个细胞的能力,至于其他的单细胞分离分析的方法,例如显微成像、毛细管电泳等,具备精准分析单细胞的组分和结构的优势,但是检测通量却较低。


因此,一种新型单细胞分离技术的开发,希望他不仅能够兼顾在分离后检测灵敏度,检测时长,通量,样品消耗量等难题的克服,而且可满足实时动态追踪单细胞活动信息,实现微量人体细胞样品的单细胞分选及分析检测成为当前紧迫的任务和挑战。微流控技术是指使用微米级别的流体通道精确操控微升、毫升级别体积样品的技术。这种结合微流设备和芯片的的微流控技术在经过很长时间的发展和改进,已实现商业化运用。目前主流且商业化主要是微流控技(Lab-on-a -Chip) 的单细胞平台。今天小编将主要介绍两种主流的微流控技术包括液滴技术Droplet及微反应室技术Microchamber的单细胞技术平台。


微流控之Droplet液滴技术

基于微流控的液滴生成技术(图1)是通过水溶液和油相从不同的微通道中流出并融合,形成一个“油包水”的乳液滴。将液滴技术运用到单细胞分离技术中即将单个细胞、反应试剂等通过微滴生成装置包被在一个油滴中形成油包水的单细胞微反应体系,从而满足多种单细胞的研究需求。

图1 液滴分离技术流程图。A 样品导入模块:包含有细胞以及荧光染料等试剂的两路独立管道;B 细胞及荧光染料等试剂融合模块;C 细胞和荧光试剂的液滴混合模块;D 细胞与染料试剂充分接触和作用模块;E液滴进入检测器检测分析模块


关于微流控液滴技术,目前市场上的代表产品有HiFiBiO的自动化细胞发现平台CelliGO以及英国Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine单细胞分析系统等。一般是通过微液滴技术将抗体分泌的B细胞包封在含有生长培养基的液滴中,当单细胞在单个微滴中分隔时,确保单克隆性,并且捕获其分泌的分子如抗体以及和一些荧光二抗提前混合入微滴内,可以进行包括蛋白质分泌速率,滴度和抗原特异性等测定,应用在单细胞基因组测序和重组免疫球蛋白表达,抗体发现、细胞系开发等领域。


如图2所示,小鼠免疫后分离和富集抗体分泌的B细胞,并使用微流控装置将其分成一个个40pl的液滴。液滴来源于两路水相,一路包含细胞或校准抗体,另一路包含有磁性纳米粒子和荧光标记检测用试剂。创建后,液滴被加载成二维阵列形式静置到一个观察腔室中,开始为IgG的分泌以及亲和力分析测定准备。每个微滴中包含有预先涂有抗小鼠kappa轻链VHH的磁性纳米颗粒,它可以将抗体捕获到beads上,最终因为亲和力的作用,抗原蛋白(绿色)以及红色荧光二抗IgG(Fc)都会与beads上包被的固定抗体的IgG片段结合从而实现检测。

图2 Droplet微液滴技术在抗体发现中的应用原理及流程

 

谈到微滴技术不得不跟大家再分享下最近在单细胞测序领域比较火的10X Genomics公司,他们主要是基于微流控液滴技术的建立的一个高通量单细胞转录组测序建库平台,前阵子10X Genomics和Bio-Rad有专利冲突的也正是由于droplet技术中的部分技术因素原因,所以目前他们开发了一种新的创造液滴的手段,但是本质原理是应该没有变化的。主要由两个核心技术组成除了下图中油包水滴的微反应环境的创建,还有创新性的巧妙在样品单细胞分离同时做Barcoding技术。

图3 基于微液滴技术的高通量单细胞转录组测序建库平台

 

10X Genomics创立之初,是为了解决当时二代测序读长过短的难题,所以最初的技术原型,是将10kb左右的DNA片段,通过这个微流控混合的设计,分配到各个液滴中去。各个液滴悬浮在油环境中,互不干扰,形成成千上万个平行的反应微体系。在每个液滴中含有能够捕获DNA的Gel Bead,上带有相同的长为16bp的Barcode,以及10bp左右,序列随机的UMI(Unique Molecular Identifiers),用于标记每一段起始的DNA或RNA模板。从而判断在测序中测得的相同序列,是来自于建库过程中的PCR扩增产物,还是不同的RNA/c-DNA模板,也就是消除PCR bias,这些对于基因表达量的量化统计至关重要。在测序完成后,可以判断所有带有同样Barcodes的序列,都来自于同一油滴(即同一个最初的10KB片段)。由此可见,10X Genomics本质也主要是对大量细胞的单细胞测序建库准备。平台本身无法直接对细胞的表型进行筛选,主要还是依赖于Cell Sorter平台。


以上这些基于微流控的液滴技术成本低、消耗样品及试剂量少,适合于需要将单细胞和其他所有参与的试剂提前独立包裹在微滴中进行单细胞分离及分析,并不适合特定单细胞的长时间实时观察分析相关的研究。


微流控技术之微反应室Microchamber

传统的微反应室技术像Fluidigm公司的C1系统是在快速自动分理处单细胞并分配到微流体芯片上的单个制备仓中,跟10X相似的是C1主要还是应用在单细胞测序的建库处理流程中,这里就不详细介绍了。


美国Berkeley Lights(BLI)的纳米光导流体平台Optofluidic Platform是结合微流控的纳升级微反应器技术 (Nano-Pen) 、光电定位技术(OEP)以及计算机系统的一体化完成单细胞分选、分析、培养以及导出功能的多功能单细胞平台。在BLI平台承载微流控体系的是其核心OptoSelect芯片。该芯片是一个精细的、集约化的、细胞运输和培养功能兼而有之的流体管路系统,由纳升级培养小室Nano-Pen和微流管道构成。微流系统可实现单细胞的运输,而通过加以特殊外力即可实现向Nano-Pen中分选入单细胞;这种特殊外力作用便是OEP技术。

图4 OptoSelect芯片的构造及Nano-Pen形状大小

    

  • 什么是OEP呢?

OEP的前身是2018年诺贝尔物理学奖获得者之一的Ashkin发明的Optical Tweeszer(OET)光镊技术,其原理是利用单个激光束通过高倍的显微物镜聚焦形成光阱,微观粒子受光压而束缚在光阱处,使用皮牛级别的力操纵和移动陷入光阱的微观粒子。这项技术在生物学上为单细胞的高分辨实验研究提供了强有力的工具,不过它被限制在需要较高强度的激光强度,且难以同时操作多个细胞要求上,此外,高的光源能量强度也会导至损坏细胞以及限制了实验持续时间。为了克服这些局限,新的光电定位技术 OEP被研究开发了出来,通过OEP技术,利用光束同时在光敏感材料上产生电势场,它能够同时并且大量的操控单细胞,并且OEP允许较低的光源能量,可以在更大的处理面积进行实验。这一技术需要光学器件和配套的芯片组件的结合来完成,如下图所示:

图5 BLI Optofluidic Platform中所使用的OEP技术原理


整个OEP部件由光学系统和光敏感材料组成。光源经过透镜选择性地照射到目标位置。入射光在基于氢化硅的光导电极作用下,在照射部位的上方空间产生局部的电场,产生电场力。通过调整入射光的位置,推动该位置的颗粒(如细胞)移动。这种光电定位OEP技术配合微孔外的微流,即可实现不依赖于荧光染料标记的活细胞定向分选和收集到纳升级培养小室Nano-Pen中。


更可喜的是,Nano-pen中在提供单细胞分选和在线分析的同时也提供单细胞培养所需的环境。最终该核心芯片被仪器的硬件系统集成到一个自动化样本库大小的设备中,包括供电系统、空气和CO2的供应管路、以OEP为基础的定位系统、放置芯片的卡槽及配备的温控培养系统、用于细胞运输和液体交换的微流控系统等。除此之外,还有检测系统的软件部与硬件相配套,用于通过对仪器部件的操作来运行实验和通过对检测元件的操作来实现特定数据的收集。因此BLI技术平台的工作流程大致是:第一步,单细胞的运输和OEP向纳升级培养小室Nano-Pen中的分选;第二步,单细胞的选择性培养;第三步在线On-Chip分析;第四步,特定Nano-Pen中的细胞输出。其中的第三步,即在线检测实验,与特定课题或项目的要求相匹配,可灵活设计,这也是该技术平台的普适性的重要体现。


Berkeley Lights单细胞光流体平台的应用

目前BLI的单细胞光导流体平台强大的功能具体应用的领域包括抗体发现、细胞克隆筛选、细胞系构建、细胞治疗研究等,具有广阔的应用前景。下图给大家展示的是应用于抗体药物发现和抗体表达细胞株构建的工作流程。

图6 BLI技术平台在抗体发现和稳转细胞株构建方面的应用

 

显而易见,BLI技术平台的运用,能够从技术层面明显缩短整个项目开发所需要的时间,同时平台所实现的整合、集约化和可实时监控的工作流程使得研发工作变得紧凑而高效,更加便于制药企业以及CRO或者研究单位的项目管理。


除了生物制药领域,在当前比较火热的肿瘤免疫治疗领域,BLI单细胞光流体技术也提供了一体化进行抗原特异性T细胞的单细胞分选以及在线实时分析T细胞增殖、表型、细胞因子及杀伤力等多参数综合分析免疫系统功能平台,为单个细胞水平的免疫学研究提供了一套最直接的全面及高效的研究方法。

图7 实时单个T细胞水平的活性检测实验到目的细胞/细胞群体导出


除了T细胞表型和功能信息的活性评估检测之外,T细胞表面受体(TCR)序列对T细胞相关研究来说也比较关键,TCR基因序列可以准确地描述了T细胞在包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和传染病等多种疾病中的动态,决定着人的免疫系统如何适应环境的变化,具有很大的科学价值。正常T细胞在没有抗原刺激的情况下,TCR基因的重排是随机的,而接受相应抗原刺激后,TCR特别是其可变区V区基因对抗原产生特异性识别,并使带有这类基因的T细胞得到优势扩增,而T细胞领域的研究者们往往最后更关注就是拿到这样的TCR的序列。BLI单细胞光流体技术可以助力TCR相关的免疫基因组学研究,帮助研究者将分析评估后的目的T细胞/单个T细胞克隆群体选择性的导出用于进行后续的下游实验如T细胞受体(TCR)测序等操作。

图8  BLI 技术平台上TCR Discovery的流程的优化


TCR 开发流程极大的简化并改进了现有复杂繁琐的方法,仅仅利用2天时间即可在线一体化的完成原来1-3个月时间里面完成的特异性T细胞高效分选(TCR筛选)及克隆和功能验证试验,帮助研究者们在最短的时间里面找到最佳的可有效结合靶抗原的T细胞抗原受体(TCR Candidates),最终直接关联下游测序流程帮助研究者们后直接获得特异性识别肿瘤抗原的TCR序列进行TCR药物开发或者用于疫苗研究等。


当然不仅仅是TCR开发,在其他T细胞修饰等技术的相关应用中都以其独特的单细胞水平的研究方式帮助研究者们去将T细胞及其受体的改造后的活性功能分析、培养、克隆等工作流程实时高效的开展完成,以数字细胞学的方式大大的加速了整个细胞生物学研究的进程。

图9 BLI单细胞技术快速评估基因编辑T细胞表型(Nature期刊)


展望

单细胞层面的研究已是生物技术大行业的大势所趋,为这样的趋势提供强有力的技术支持,无论对于行业还是对于企业自身,都是一件极有意义和前景的事情。小编相信,这些技术平台未来在基础研究的层面将会大有可为,在产业界的医药产品开发中也会发挥越来越重要的作用。


参考文献

1.High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer,Nature Genetics volume 51, pages1060–1066 (2019)

2. Single human B cell-derived monoclonal anti- Candida antibodies enhance phagocytosis and protect against disseminated candidiasis,Nature Communications volume 9, Article number: 5288 (2018)

3. A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture. Journal of Visualized Experiments, 2016(112).

4. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device, Nature Communications Biology, Article number: 41 (2018).


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