技术丨超敏免疫诊断（Immuno-PCR）

体外诊断主要有生化、免疫和分子等技术分类，其中免疫和分子各自有自己的标志物。之前的推送介绍了如何用免疫检测原理进行核酸分子的检测，其中以杂交捕获2作为典型例子进行说明。这种方法主要依靠抗体对DNA/RNA杂合体的特异性识别，尽管灵敏度不够，但使用简便，也适应HPV的检测需求，目前已经成为HPV检测的经典方法之一。

多年来一直依赖免疫检测技术，如蛋白质印迹、流式荧光免疫、ELISA和化学发光进行免疫检测，这些方法已经发展成为IVD免疫诊断最重要的技术支撑。但有些低丰富的蛋白仍然难以检测，特别是目前医学的发展，对高敏免疫检测的需求愈发严重。免疫PCR（immuno-PCR）是一种相对较新的方法，它的出现就是为了解决传统ELISA灵敏度不够的问题。通过将ELISA与PCR合并，免疫PCR提供了极高水平的测定灵敏度。

该技术最早报道于1992年Science的一篇文章。文章指出该技术可重复稳定地检测580个抗原分子，与传统方法比灵敏度提高了100000倍。目前，该技术已经成为最重要的超敏免疫检测技术之一（类似的技术之前有Digital ELISA-Simoa）。

在Sano等人进行的免疫PCR中，将牛血清白蛋白（BSA）固定在微量滴定板上，然后用附着有链霉亲和素蛋白A蛋白嵌合体的单克隆抗体进行检测。然后将生物素化的线性DNA加入孔中，通过PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳分析。随后，该方法发展成为利用qPCR进行定量的超敏检测，最低可在1毫升溶液中检测几个生物标志物。

免疫PCR测定的主要步骤如下图所示：

• 将特异于蛋白质靶标的抗体固定到容器表面

• 洗涤以去除未结合的抗体

• 添加样品

• 洗涤以去除未结合的样品

• 添加与DNA分子偶联的第二特异性抗体

• 洗涤去除未结合的抗体

• DNA扩增和检测

目前，该技术已经有多种形式。其中最常见的是利用生物素标记的核酸分子进行信号扩增（图a）。免疫PCR难点之一在于抗体与寡核苷酸缀合的技术复杂性和稳定性。然而，抗体缀合技术的新发展意味着现在可以更有效地进行免疫PCR，特别是生物素标记核酸技术的成熟，使得这种技术逐步实现商业化。

ELISA是一种免疫测定，目前有三种不同类型的ELISA。直接ELISA，夹心ELISA和竞争ELISA。其中夹心法用于检测大分子，竞争法用于检测小分子。ELISA易于操作，运行相对便宜，并且可用于高通量筛选。

PCR是用于扩增特定DNA片段的技术。传统PCR扩增的产物DNA在凝胶上运行并用溴化乙锭染色。实时定量PCR（qPCR），将PCR产物的产生与荧光强度相关联，通过监控其荧光信号进行核酸检测与定量。qPCR非常灵敏，且比免疫检测具有更宽的动态范围。

免疫PCR本质上综合了两种方法的优点，只要有适当的抗体试剂，ELISA就可以检测到任何蛋白质，但它可能不够灵敏，无法鉴定低丰度的蛋白质。虽然PCR提供指数信号放大，但它不能直接用于抗原检测。免疫PCR通过抗体-寡核苷酸缀合物，利用PCR的方法放大信号，使免疫检测拥有了超高的灵敏度。

免疫PCR最主要的特点如下：

高度敏感：可以检测皮克，飞克量的分析物

低样品消耗：由于灵敏度高，检测通常只需要少量样品

通量高，多路复用

免疫PCR最成功的平台是由Chimera Biotec GmbH（德国多特蒙德的生物技术公司）开发的IMPERACER平台。Chimera Biotec GmbH总部位于德国，其主要开发和销售超敏蛋白检测平台，具有三大生物分析检测平台：ELISA、IMPERACER和SIMOA，三种技术平台有其各自优缺点。其中IMPERACER就是采用的immuno-PCR技术。

IMPERACER将抗体偶联DNA作为检测试剂，通过real-time qPCR扩增来确定检测结果。和传统ELISA相比，具有以下几点优势：灵敏度高1000倍，检测范围达到五个数量级，基质背景低，需要样本量少。

其公司在2007年在Nature Protocols上发表有immuno-PCR的相关指导文章。和Digital ELISA类似，目前这种高灵敏的免疫检测技术主要应用于各种细胞因子的检测。其它检测项目还有传染病、代谢疾病及神经病学等高灵敏生物标志物检测。

另一个平台是RayBiotech开发的Immuno-Quantitative ELISA (IQELISA™)，但该系列产品主要面向科研市场，在临床上应用较少。