人类免疫缺陷病毒HIV感染导至艾滋病AIDS目前还没有疫苗可以预防,也没有治愈这种疾病的有效药物或方法。目前,艾滋病仍是威胁我国公众健康的重要公共卫生问题。截止至2018年年底,中国存活艾滋病感染者约125万,其中近30%对自身患病不知情。2018年新发记录感染64170人,死亡18780人。HIV感染可通过抗体、抗原(p24)和核酸(HIV-RNA)进行诊断,该推送主要介绍目前国内企业所采用的诊断技术和NMPA批准的详细情况。
联合国艾滋病规划署提出在2020年实现90%感染者通过检测知晓感染状况。由2018年的卫健委统计数据显示,我国还有30%,近40W感染者不知其感染状况,任务十分艰巨,市场也很巨大。HIV检测分为初筛检测和确认检测。目的不同,所使用的方法也有所不同。就检测项目来说,HIV感染可通过抗体或核酸(HIV-RNA)或抗原(p24)检测进行诊断。因此,其检测方法也分为蛋白检测和分子检测。
HIV诊断方法汇总
Western 印记(蛋白印迹法):免疫印迹法是确认HIV感染的金标准,其具有很高的特异性。严格来说所有的HIV感染确认都应该做这个实验。基本原理如图所示:
样品经蛋白质变性后进行凝胶电泳,蛋白质以分子量大小进行分离。常用的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法,核心原料有聚丙烯酰胺凝胶PAGE和负载十二烷基硫酸钠SDS的缓冲液。
将它们从凝胶内移动到由硝酸纤维素(NC)或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。常用的转移蛋白质的方法称为电印迹。硝化纤维素膜比PVDF便宜,但更脆弱,不能经受多次探测。
使用牛血清蛋白、奶粉等溶液进行多余位点的封闭。
加入HIV抗原/抗体(第一抗原/抗体),识别并结合特定的靶蛋白。
在洗掉过量未反应的抗原/抗体,添加第二抗原/抗体,其识别并结合第一抗原/抗体。
再次洗掉多余未反应的抗原/抗体。
通过各种方法(例如染色,免疫荧光和放射性)使二抗可视化,检测特异性靶蛋白。
蛋白印迹操作复杂,耗时较长,无法实现便携式的现场检测(POCT)。
免疫层析法:目前市面上使用较多的快检平台主要是免疫层析法(LFA),即试纸条。该法主要分四代,每一代的具体区别如下表。
检测物 | 原料来源 | 检测原理 | 窗口期(天) | |
一代 | IgG抗体 | 病毒裂变产物 | 间接法 | 35-45 |
二代 | IgG抗体 | 基因重组抗原合成肽 | 间接法 | 25-35 |
三代 | IgG/IgM抗体 | 基因重组抗原合成肽 | 双抗原夹心法 | 20-30 |
四代 | IgG/IgM抗体 p24抗原 | 基因重组抗原合成肽 p24抗原单克隆抗体 | 双抗原夹心法 双抗体夹心法 | 15-20 |
试纸条是目前应用很广的快速检测平台。广泛应用于孕检、HIV等的快速诊断。其示意图如下所示:
样品垫:用于样品的滴加并储存多余的样本。样本由于毛细力的作用沿着样品流动方向流动。
结合垫:含有信号物质标记的抗原或/和抗体(常用金纳米颗粒,乳胶颗粒,荧光分子等),其能捕获样本中HIV抗体或/和HIV抗原。并被毛细力驱动到反应膜上。
反应膜:一般分为质控线(C)和一条或者多条检测线(T)。
吸收垫:提供驱动力,收集废液。
试纸条的制备非常简单,检测时间也很快,是目前HIV筛查最常用的方法。但该法容易出现假阳性或者漏检。目前最新的方法是采用荧光物质等进行信号标记,使用便携式的荧光阅读仪实现半定量或者定量检测。
酶联免疫/化学发光/时间分辨荧光:在之前的推送中详细分析了国内四强和国外四强的化学发光平台原理和性能对比。这里说一下酶联免疫(ELISA)。本质上酶联免疫和化学发光类似,最大的不同在于其属于异相免疫测试,在反应速度,效率,灵敏度等有所缺陷。
时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)是以镧系元素标记抗原或抗体,并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术,它根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。
反转录PCR(RT-PCR):简单来说,在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA复制。其有一步法和两步法之别,区别在于是否在同一个缓冲盐和酶体系中进行。其反应原理如图所示:
RNA的提取。一般使用含有苯酚、异硫氰酸胍等物质的提取液,破碎细胞释放RNA并抑制细胞释放出的核酸酶。收集上清液后使用高盐溶液沉积后收集RNA。
RNA加入含有逆转录酶、引物、dNTPs的反应体系后cDNA的合成。
利用合成的cDNA进行常规PCR反应。
反转录PCR能够检测很灵敏的HIV RNA,是目前HIV RNA最常用的方法之一。
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