| 大家还记得前段时间都教授让千颂伊同学去学习16S分析吗？（点击这儿回顾）没错，小千同学已学成归来，为了考察学习成果。都教授问了千颂伊几个问题。 
OTU就是按照序列97%相似性进行筛选得到的一类核苷酸序列。
每个样本对应的reads数量差距较大，为避免因样品数据大小不同而造成分析时的偏差，在样品达到足够测序深度的情况下，需对每个样品进行随机抽平处理，获得统一的基数，从而准确预测OTU的丰度。
哈哈，这个问题难不倒我。每个OTU中存在多种相似性在97%以上的read片段，每种read条数不等，做物种比对时，通常选择reads数量最多的核苷酸序列。
嗯，嗯，那个，那你有没有偷学到宏基因组测序的知识？作为微生物测序研究的常用手段，16S等扩增子测序与宏基因组测序经常被拿来比较。we all know宏基因组可深入到基因水平进行代谢研究，但二者还有哪些本质区别？为何宏基因组如此火热？你，真的都懂吗？是否有些疑问埋藏在心里很久，却始终找不到满意的答案呢？没关系，今天小锐就带大家感受一下撕名牌的畅快，将所有疑难通通out掉。16S rDNA基因存在于所有细菌的基因组中，具有高度保守性。然而该基因序列还包括9个高变区（V1-V9），通过特异性引物对某一段高变区（如V3区）或某几段高变区（如V3-V4区）进行扩增测序，然后与数据库比对，可特异性识别细菌种类。将基因组DNA随机打断成若干条500bp的小片段（类似于拼图中的单个形状不一的模块），然后连接接头（双端120bp），在片段两端加通用引物进行PCR扩增测序。将reads进行组装拼接（类似于将众多模块拼成一副完整图片），得到基因序列，众多基因构成完整的基因集。同时将获得的reads片段或组装好的基因序列与NCBI数据库进行比对，得到物种注释结果。对于16S测序而言，任何一个高变区或几个高变区，尽管变异性再高，对于某些物种来说，这些高变区也可能十分相近，而能够区分它们的特异性序列片段有可能不在我们的扩增区域内。换言之，非全长的可变区序列覆盖范围不够导至无法鉴定到种。宏基因组在建库之前会先将基因组DNA随机打断成若干小片段，而这些小片段中总有一些能够包含区分2个物种的基因差异序列。由于测序深度足够深，相当于覆盖了整个基因组的信息，因此在与NCBI数据库比对时，就能够注释到相应的种水平的物种。有客户用同一批样品先做了16S测序，然后又做了宏基因组测序，比较之后，发现宏基因组注释上的物种竟然比16S注释上的少很多。这是为什么呢？尽管上述问题会对数据质量和物种比对结果造成一定的影响，但即使不存在上述问题，宏基因组可注释出的物种仍然要比16S少。我们来看看下面这篇发表在Science上的文章[1]是如何描述和解释这一现象的。研究发现：用同样的样品分别进行宏基因组和16S测序分析，16S在门、纲、目、科、属水平注释上的物种均多于宏基因组，而宏基因组仅在种水平注释上的物种组成显著多于16S。此外，两种方法注释到门水平的物种的相对丰度也存在差异。文章认为，即便是同一个样品，由于建库、测序、分析手段不同，结果也会有所差异，因此很难通过对比的方法去判断哪种方式更准确。
对此，小锐只能说，二者各有优势，就看各位科研宝宝的研究目的了。16S与宏基因组进行物种注释时用到的数据库并不相同：前者用的是核糖体数据库项目（RDP）或Greengenes数据库；后者用的是NCBI数据库，不仅包括核糖体基因，还包括细菌、真菌、古菌、病毒的其他基因片段。宏基因组与16S在分析上有很多相同之处，如均可以进行物种分类和丰度分析，但二者也有区别，最显著的一点就是宏基因组可以进行基因水平的分析，从而研究微生物代谢功能。或许大家要问：16S现在不是也有功能预测吗？是的，尽管准确率高达84%-95%，但16S的功能预测只能做到KEGG第三层级，我们无法通过map图看到每种代谢内部基因调控的酶的变化。而宏基因组通过基因序列进行功能注释，可以准确分析每个基因参与哪些代谢通路、调控何种酶的合成、如何变化。简言之，想研究微生物背后的运作机制，只能通过宏基因组手段。美好的一天在千颂伊同学的认真学习中结束了，看着她自信满满的笑容，小锐知道，这妮子肯定又学到了不少东西。相信此刻坐在电脑前翻看手机的你，对于16S和宏基因组测序的原理性知识也有了很多了解。大家的成长就是小锐的快乐。[1] Zhernakova A, Kurilshikov A, Bonder M J, et al. Population-based metagenomics analysis reveals markers for gut microbiome composition and diversity[J]. Science, 2016, 352(6285): 565-569. |
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