免疫化学发光并非万能，单分子免疫检测未来可期（下篇）

前言

       化学发光技术已经成为当前免疫诊断市场中最重要的检测技术。自上世纪70年代诞生以来，尽管随着检测设备全自动化水平以及检测元件精密度、试剂生产保存工艺的发展，化学发光技术的检测灵敏度有了显著的提升，然而究其本质而言，无论是酶促发光、直接发光或是电化学发光，化学发光技术在检测原理上在过去的近50年里并没有得到任何改变。可以认为在自动化水平已经达到相当高程度的今天，化学发光技术在现有抗体亲和力水平的前提下，已经接近了其检测能力的极限。

免疫诊断市场在新型标志物或新型诊断市场上的开拓，可能需要一种从检测原理层面进行变革的新型免疫诊断技术——单分子免疫检测。

       本文将分为以下几个部分探讨下一代免疫诊断技术——单分子免疫检测对现有免疫诊断市场的影响以及在体外诊断市场普及应用的可行性。

上篇我们介绍了以下内容:

（1）  化学发光发展现状

（2）  单分子检测技术——生物检测技术的极限标尺

（3）  从化学发光到单分子免疫检测有多远

（4）  数字PCR技术的发展给单分子免疫检测的启示

下篇聊聊以下部分：

（5）  单分子免疫检测技术发展现状

（6）  单分子免疫检测平台技术分析

（7）  单分子检测技术是分子检测与免疫检测平台统一化的可行桥梁

（8）  超低成本单分子免疫检测技术实现的可能性

5.    分子免疫检测技术发展现状

单分子免疫检测是指通过免疫标记的方法，利用抗体捕获和识别抗原，进行信号分子标记或是酶联标记的形式，通过单分子荧光信号检测或单分子酶促反应实现的单分子级别蛋白分子的检测，其检测灵敏度远超现有的化学发光技术平台。

目前全球范围内，已商品化的单分子级别免疫检测的技术平台仅有Quanterix公司的SiMoA系统和Merck的SMC系统。

美国Quanterix公司的创始人是David Walt，他是美国塔夫茨大学化学系的教授，不仅是美国国家科学院和工程院的双料院士，还是基因测序龙头企业Illumina公司的创始人。

2007年，David Walt在美国马萨诸塞州创立了公司QuanterixCorporation，首次推出SiMoA技术。

2013年该公司上市了科研系列产品——基于SiMoA技术的检测设备。

2015年推出第二代基于SiMoA技术的检测设备，并于该年取得1000多万美元销售额。

2017年，公司实现超过2000万美元的销售收入。

SiMoA（Single Molecule Array）系统源自于DavidWalt与David Duffy的团队开发的一套“DigitalELISA”检测系统。其检测原理与数字PCR近似，都是通过微反应器单元进行单分子隔离结合单分子水平信号放大来实现的。

SiMoA系统通过免疫反应将磁珠捕获的抗原分子使用半乳糖苷酶标记，再将其分散到微米尺度的微孔阵列中，通过使用油相进行物理上的隔绝，让微孔中单分子半乳糖苷酶进行酶促反应，产生荧光信号。其检测端与数字PCR相同，使用“0”与“1”对根据微孔荧光强度进行标记，通过“1”和“0”的计数和占比分析实现单分子计数以及超高灵敏度的蛋白检测分析。

表2 Quanterix Corp融资历史   

由于SiMoA技术远远领先于现有的各类免疫诊断技术，其单分子水平的检测能力更是被认为“将改变整个蛋白标志物检测市场游戏规则”，因而深受资本市场的认可。

Quanterix公司的融资历史如表2所示，公司于D轮获得了5450万美元的融资，其中包括了国内企业乐普医疗通过乐普-民和全球精准医疗创新投资基金增资的1100万美元，用于公司IVD产品的开发注册与推广。公司于2017年末在纳斯达克上市。

SiMoA系统的出现，彻底打破了免疫诊断市场中，现有的检测技术在检测能力或检测灵敏度水平的极限，使得单分子蛋白检测成为了可能。受限于SiMoA复杂的操作流程以及难以控制的高昂试剂耗材制造成本，尽管Quanterix公司2016、2017年已实现1758.50万美元、2287.40万美元的营业收入，其亏损额度却高达2317.3万美元和2701.9万美元。

但是，这依然不能阻碍SiMoA系统所代表的单分子免疫检测技术成为近几年海外在免疫检测技术当中最趋之若鹜的方向。

继SiMoA系统之后，Merck公司主推的SMC（SingleMolecule Counting）系统最早由Singulex公司开发，于2015年由MerckLife Technology收购其生命科学领域的使用权。Erenna系统是SMC第一代单分子检测设备，该设备通过流式分子扫描检测的方法，实现分子计数功能。

由于受限于Erenna设备的制造成本和稳定性问题，2018年初，Merck公司推出了第二代单分子免疫检测设备SMCxPRO。SMCxPRO于2018年5月前后在国内市场开始推广，国内单台设备售价超过20万美元，96人份·的试剂盒市场售价均超过2000美元，研发用试剂盒更是高达6000美元（30test）。截至目前为止，该设备国内销量已超过6台。

与SiMoA技术使用的单分子酶催化信号放大策略不同，SMC技术采用更为直接的设备依赖型单分子检测方法。SMC系统中，将激光聚焦到光学极限尺度范围内，使得微米尺度的聚焦光斑范围内的激发光源能量达到一个极高程度。在这个光斑中，通过免疫反应标记的单个或数个荧光染料分子将释放出足够多的光子以确保被PMT检测到，实现单个分子的计数功能。

继SiMoA系统之后，SMC系统再次让单分子免疫检测技术进入相关领域的视野，进一步引发业内人员对下一代免疫诊断技术的思考。

6.    单分子免疫检测平台技术分析

6.1 SiMoA系统

图3 SiMoA操作流程示意图

图4 SiMoA HD-1 Analyzer设备图

SiMoA通过磁珠酶联免疫反应与微孔阵列芯片的结合，实现单分子蛋白检测。其操作流程如下：

（1）利用表面标记有捕获抗体的磁珠捕获样品中的抗原；

（2）使用biotin标记的检测抗体对被捕获的抗原进行标记；

（3）加入链霉亲和素——半乳糖苷酶复合物，与检测抗体上的biotin结合；

（4）将反应洗净后的磁珠与底物混合，加载到含有微孔阵列的检测芯片中，利用磁场使磁珠落入与其尺寸完全匹配的微孔中（3μm左右），加入油相，使得微孔之间物理隔离；

（5）含有半乳糖苷酶的微孔由于酶分子催化底物产生荧光产物；

（6）对微孔阵列进行荧光成像，通过对发出荧光信号的微孔个数对照标准曲线来实现定量检测。

SiMoA系统实际上沿用了数字PCR中的单分子信号放大的方法，通过酶联免疫进行抗原分子酶联标记，再通过酶催化荧光底物的方法替代数字PCR技术中PCR来实现信号放大。根据目前Quanterix官方公布的数据，SiMoA系统是当前全球范围内检测灵敏度最高的免疫检测系统，其cTnI检测下限达到了0.05pg/mL，且是唯一官方公布能兼具蛋白检测与核酸分子检测的通用技术平台。

然而，SiMoA系统存在很明显的一些缺点：

（1）检测操作流程过于繁琐复杂。

一方面使得检测设备的复杂程度增加，体积庞大，造价和维护费用高昂。另一方面增加了检测过程中，各个步骤不确定性叠加带来的严重的稳定性问题，尤其是检测体系中使用的半乳糖苷酶与FDG荧光底物都存在明显的稳定性问题。

（2）SiMoA系统使用的盘式微流控芯片加工精度高，生产成本高昂。

由于半乳糖苷酶催化效率远比酶联免疫中常用的HRP酶催化效率低，为了确保生成的荧光产物能集中浓缩到足够大的浓度，理论上必须尽可能缩小微单元的尺寸。根据笔者个人研发经验，当液滴尺寸大于10 μm后，半乳糖苷酶在其分子寿命内催化产生的荧光信号将难以和背景信号有效区分。

SiMoA系统使用了接近微米加工体系极限的3 μm微孔阵列以确保半乳糖苷酶催化产生的荧光信号能够准确识别，使得其芯片加工成本远远超过目前IVD市场所能接受的范围。而另一方面，由于在磁珠与底物载入微孔，利用油相密封之前，磁珠与底物是预先混合的，为了尽可能降低背景信号，需要对磁珠载入微孔并密封的步骤进行严格的时间控制，这也进一步提高了对设备精密度的要求。

（3）SiMoA检测系统单次检测耗时长达1小时以上，远超过目前免疫诊断市场中已经能轻易实现的15分钟报告时间。

因而，综合考虑检测成本、检测效率、检测试剂稳定性、后期维护成本等一系列因素，SiMoA系统在推广至临床诊断市场时必将面临明显的阻碍。

6.2  SMC系统

图5 SMC工作原理图

图6 SMC第一代检测设备Erenna与第二代检测设备SMCxPRO

SMC系统是设备依赖型的单分子检测技术。与SiMoA通过降低反应单元体积，浓缩荧光产物的思路不同，SMC采取的是更为直接的通过激光聚焦的形式提高免疫标记的少数几个荧光染料分子的光子产量，来实现单分子的计数检测。

SMC进行单分子免疫检测的步骤如下：

（1）利用标记有捕获抗体的酶标板或磁珠捕获抗原

（2）使用标记有数个荧光染料分子的检测抗体对抗原进行荧光标记

（3）将抗原与荧光标记的检测抗体使用专用洗脱液洗脱，转移至检测孔中

（4）使用设备进行单分子计数。

SMC系统第一代检测设备是Erenna，是一种流动式的荧光分子扫描系统。进行荧光分子扫描时，需要使溶液中的洗脱下来的荧光分子逐个通过极小的检测窗口。在检测窗口中，利用激光聚焦技术将高功率激光聚焦到微米尺度，形成艾里斑（Airydisc），一方面可以避免多个抗原标记的荧光分子出现信号叠加，另一方面可以在光学极限尺度下尽可能提高检测窗口激发光源的能量，提高单一抗原标记的仅有的少数几个荧光分子的光子产量，确保单分子信号与背景噪音区分开。

然而，这种检测方法带来了几个问题：

（1）由于检测窗口很小，几十微升甚至上百微升体积的洗脱液要全部流过检测窗口将花费大量时间（数十分钟），且由于操作环境的干扰，检测窗口的液体通道极易堵塞，需要使用专门过滤处理过的洗脱溶液。

（2）艾里斑处于光学衍射的极限，这使得设备对光学系统的调校精准程度和设备操作环境的稳定性都有着极为严苛的要求。

为了解决该问题，Merck公司推出了第二代SMC设备SMCxPRO。第二代SMC系统兼容磁珠与多孔板的抗原捕获方式，但是为了降低反应背景和避免磁珠透光度有限造成的光源或发射光遮挡的问题，依然必须进行荧光分子的洗脱，并使用专用检测孔装载检测液检测。SMCxPRO改变流动式扫描荧光分子的形式，改为通过旋转光源，在检测孔中对三维尺度的洗脱液进行扫描，从而显著提高分子计数的效率。该检测方法严格意义上已经脱离了单分子绝对计数的概念。由于溶液中的荧光分子存在布朗运动，分子运动轨迹不可预测，这使得检测过程中存在分子重复计数或漏检的可能性，一定程度上降低了检测灵敏度，理论上需要算法辅助校正。

在单次完整检测耗时上，二代SMC系统尽管已经在一代系统的基础上进行了显著改善，但是单次检测依然需要超过4个小时。综合来看，SMCxPRO依然只能用于科研级别检测分析（事实上Merck公司对SMC技术的定位也仅限于科研领域），尽管该系统检测灵敏度远超目前主流的各大化学发光技术平台，但其他方面的特性远未达到医疗诊断产品的要求。

7.    单分子检测技术是分子检测与免疫检测平台统一化的可行桥梁

分子检测与免疫检测在检测平台上的统一是体外诊断领域业内人士一直在探讨的问题。分子与免疫检测在检测平台上的统一不仅可以显著降低检验科室，特别是门诊量大的三甲医院检验科室的空间资源成本、人工成本、设备终端采购成本、维护成本以及试剂成本，更有可能从根本上杜绝核酸扩增过程中产生的气溶胶污染问题，并显著降低分子诊断的耗时。

目前市场上的分子检测产品实现高灵敏、高特异性检测分析的基础是核酸扩增方法指数级信号放大的方法和PCR引物的高特异性，而免疫检测体系更多的则是依赖于抗体对抗原分子结合的高亲和性与高特异性。

由于分子检测与免疫检测在方法学上的根本差异，使得二者之间有着难以逾越的鸿沟。

然而，对于单分子检测技术而言，分子与免疫的检测却是有可能实现检测技术平台上的统一——以单分子级别的检测技术，通过牺牲灵敏度的形式放弃核酸扩增步骤，使用更为简单却依然保持有良好特异性的分子杂交形式进行核酸分子的检测。

这种检测形式除了可以显著降低分子诊断所需时间，轻易实现类似于RNA、mRNA等的单链片段核酸分子的检测，更重要的是由于不需要核酸扩增，可以彻底解决目前分子诊断中最为麻烦的问题——气溶胶污染，从而显著降低分子诊断实验室的环境控制要求。SiMoA能同时进行高灵敏度蛋白与核酸检测正是采用了这一策略。

实际上，使用现有的单分子免疫检测技术平台，通过分子杂交的方法，完全可以实现pM（与PCR近似灵敏度）以下甚至接近fM水平核酸分子的检测。SMC系统由于可以在分子探针上直接标记荧光分子或荧光分子团簇，理论上也不存在核酸与免疫检测平台统一的技术壁垒。

相信随着单分子水平检测技术的发展，分子与免疫检测在技术平台上的统一将可以很快实现。

8.    单分子检测技术发展瓶颈与发展趋势

其实无论是数字PCR，或是单分子免疫检测技术的SiMoA系统和SMC系统，对于现阶段体外诊断市场，他们的发展瓶颈都集中体现在现存的体外诊断体系下，下一代诊断技术在过渡发展期的两个核心问题：（1）成本；（2）替代的必要性。

而这两个问题却是最需要时间来消化。当我们回顾体外诊断技术发展的历程，就会发现无论是化学发光技术或是实时荧光定量PCR技术，其诞生时间都并不比酶联免疫或是传统PCR晚多少。从化学发光技术对酶联免疫技术的替代、实时荧光定量PCR技术对传统PCR技术的替代，也都经历过类似的过渡时期。而他们之所以能成为现在体外诊断市场核心技术，正是由于时间推动了技术的发展，解决了上述两个核心限制性问题。

作为生物检测技术的极限尺子，单分子检测技术取代现有诊断技术成为市场的主流有可能是将来体外诊断市场发展的趋势。

与传统检测技术相比，单分子检测技术的核心意义并不体现在能对现有的体外诊断系统能提供多大程度的改善，而是体现在将来为体外诊断市场的纵向拓展提供了多大的可能性。所以笔者认为，对于单分子级别检测技术的投资，实际上是对下一代检测技术的投资，需要用更长远的眼光去关注3年、5年乃至10年后生物体外诊断技术的发展趋势，提前做出布局。

9.    超低成本单分子免疫检测技术实现的可能性探讨

SiMoA系统和SMC系统代表了现有技术下，实现单分子免疫检测的两种技术策略，即以信号放大的形式来降低检测设备灵敏度需求和以提高检测设备灵敏度的形式来实现分子级别的计数。两种策略中，前者的技术成本和风险集中于试剂，而后者则主要集中在检测设备上。

针对现有的体外诊断市场特点，笔者认为前一策略短期内相对而言将具有更大的发展潜力和应用空间。SiMoA系统受限于操作体系的复杂程度和微流控芯片生产、控制的成本问题，暂时还难以真正盈利，大规模推广向医疗市场。但是，如果能寻找到一种更为廉价，甚至可以以POCT产品能够接受的成本实现信号放大与检测，相信单分子免疫技术替代化学发光的一天将很快到来。

厦门宇测生物科技有限公司   官志超

作者简介：

官志超，厦门大学硕士。2009年师从杨朝勇教授正式进入实验室，从事于微流控芯片、数字化PCR、单分子蛋白检测、POCT新方法的研究。硕士期间以一作身份发表Angew.Chem. Int. Ed.（IF 12.1）两篇，Anal.Chem.（IF 6.0）一篇，Biomicrofluidics（IF 2.6）一篇，二作身份发表AMI（IF 8.0）一篇。2014年因研发的新技术获得投资，放弃ETH公派博士offer，投入创业，组建厦门佰盛特生物科技有限公司。作为公司副总经理负责新型POCT技术的研发、生产及医疗器械批文申报，具有丰富的研发、生产、管理和注册经验。18年因AstraSystem技术获得突破，独立组建团队，成立厦门宇测生物科技有限公司。

厦门宇测生物科技是国内首家从事于单分子免疫诊断技术产业化的高科技型企业。公司目前已完成低成本、易操作的单分子免疫检测技术的研发和转化，将真正实现超低成本单分子免疫技术在医疗诊断市场的应用。