学术前沿 | cfDNA用于肿瘤诊断的检测策略

今天介绍一篇关于利用cfDNA进行肿瘤分子诊断相关方法介绍的综述A field guide for cancer diagnostics using cell-free DNA: From principles to practice and clinical applications，本文从cfDNA的性质、提取方法、突变检测方法、优缺点及应用潜力等方面进行了详细介绍。

• Sanger sequencing
• Quantitative PCR
• dPCR and ddPCR
• NGS or massive parallel sequencing
• Whole-Exome Sequencing or Whole-Genome Sequencing
  
  

• Upfront testing for mutations: Can liquid biopsy identify cancer patients de novo?
• Primary testing for targeted therapies using liquid biopsy
• Longitudinal testing: Tracking tumors during therapy
• Testing for resistance to treatment variants: Second line therapies
  
  

1948年Mandel和Metais在人类血液样本中发现了cfDNA，之后人们又发现肿瘤患者的cfDNA含量远高于健康人群，这些cfDNA存在于人体的大循环中（如下图所示），也在膀胱癌、结直肠癌和非小细胞肺癌患者的尿液中有发现，另外在粪便、唾液、脑脊髓液及胸腔积液中都观察到了cfDNA存在的证据。

虽然对于cfDNA的发现和关注越来越多，但是关于cfDNA的起源和释放机制，仍然没有完全透彻的被理解，目前cfDNA来源的假设主要有来自细胞凋亡、裂解以及外泌体的释放，因此我们可以利用cfDNA的检测来进行肿瘤诊断。在肿瘤患者的血液中ctDNA含量可以从<0.001%到高于60%，当然这与肿瘤体积以及肿瘤发展阶段是相关的（图B）。

为了临床诊断的需求，我们需要从不同组织中提取出cfDNA，目前市场上已经有很多用于cfDNA提取的商业性试剂盒，但效果差异较大。文章提到了对cfDNA提取效果的研究，有56个不同的实验室参与了对同一个标准血浆样本的提取，但结果得到的cfDNA含量差异较大，从2.87ng/ml到224.02ng/ml，平均23.15ng/ml。由于cfDNA的含量会大大影响突变检测的灵敏度，因此对于cfDNA的分离和富集非常重要。此外cfDNA在不断的释放同时也在不断被清除，血液中DNA半衰期大约是2小时，对于临床样本如何快速有效的提取cfDNA是目前需要突破的一个问题。

接下来，文章提到对于突变检测的标准，我们需要关注1)、检测的准确性和精确性，2)、结果的稳健性，3)、灵敏度以及检测特异性。文章提到目前已经发表的报道中，对于检测到的突变频率阈值从1%到0.001%都有，这些方法包括dPCR、BEAMing以及CAPP-seq等。不过上述这些能检测到的极低频率依旧依赖于提取到的cfDNA含量，例如我们要检测一个0.001%（即100,000中有1个）频率的杂合突变，在这个位点至少需要100,000个覆盖，正常人类单个细胞约有6.6pg基因组，就需要660ng的cfDNA才能达到0.001%，如果需要大于1个覆盖度来排除假阳性的话，那么挑战就更大了。

目前用于肿瘤诊断的突变检测方法有桑格测序、定量PCR、dPCR和ddPCR以及NGS。对于NGS在常规诊断中要达到高灵敏度的检测，目前较为实用的方法是分子标签加上iDES去除背景错误，可检测到频率0.1%的突变。

和组织相比较，cfDNA的检测更加方便、快速，但由于目前的NGS实验及检测方法的局限性，组织活检依旧是金标准。