信不信？高效分离外泌体，几小时就能搞定！（附外泌体数据库）

外泌体素来放荡不羁爱自由，时不时就在机体内来场说走就走的旅行。为了不使旅途寂寞，外泌体通常是与核酸分子（DNA/RNA）、蛋白质搭伴而行。因而，它在巧遇细胞时总会插手别人家的家务事，并凭此晋升为液体活检的“新贵”，姑且也算得上是科研界里的“万人迷”。

显然，外泌体作为一个“好苗苗”，应用前景也是一片光明。而要想深挖外泌体的潜能，使其发挥更大的作用，必先获得高纯度、内含物少丢失的外泌体样本。但生物样本的复杂性、外泌体本身的异质性等因素都使得外泌体提取分离过程异常艰难。在此，小编稍微露露肌肉，显示一下实力，给大家推荐四种快速并高效分离外泌体的方法。

超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，在以低速离心除去掉死亡细胞和细胞碎片后，就通过高速离心将大小相同的囊泡颗粒从可溶性分子如游离蛋白质和蛋白质复合物中沉淀并纯化出来。

重要的是，随后要用PBS或新鲜生长培养基至少一次的清洗外泌体，从而来减少其中游离的残存蛋白。此外，所有离心步骤必须在4°C下进行，借此来保持蛋白酶、DNase和RNases处于非活性状态。

通常超速离心也会与蔗糖密度梯度（其密度从低到高的连续分布）或蔗糖垫（30% sucrose cushion）组合使用，即在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀（含有外泌体）120分钟，可使样品中的外泌体应将以1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。

尽管这种强强联手的方法可以获得高度纯化的外泌体，但也存在一些缺点。确实，超速离心的过程耗时耗力，且需要耗费大量的原料。而最大的缺陷在于重复离心操作很有可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，又或者样品中的可溶性蛋白可能与外泌体一起形成聚集体和团块进而产生污染。

考虑到外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，也可依据其大小来分离外泌体，如超滤和尺寸排阻色谱（SEC）。

超滤是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，即将溶剂即部分小分子物质过滤到膜的另一侧，而将大于膜孔径的高相对分子质量物质截留在超滤膜上，以此达到分离外泌体的目的。

该方法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是研究外泌体RNA的最佳方法，因为它比超滤和沉淀法产生更大的RNA产量。同样可以通过纳米过滤浓缩器。但超滤的主要缺点就是外泌体可能会阻塞过滤孔，导至膜的寿命减短，分离效率较低。

外泌体膜之间也会发生互相黏附，致使低分离产量，甚至会出现错误的检测结果。此外，基于体积大小分离外泌体的方法还有一个需要解决的干扰，那就是与外泌体大小相似的大量非外泌体的纳米囊泡的存在。

在SEC中，柱内固定的多孔相也可利用重力流原理，依据分子大小来进行选择性分离。小分子能够穿过孔隙导至后期洗脱，而较大的组分（包括外泌体）则可绕过孔隙提前被洗脱。此方法可使外泌体完整性和生物活性得到极大保留，且与差速离心结合获得高度纯化的外泌体。

聚乙二醇（ PEG，8000 kDa）可竞争性结合游离水分子，从而使溶解度较小的分子或外泌体从溶液中析出。早期该方法被应用于从血清等样本中收集病毒，现也被用来沉淀外泌体。通常是4℃用PEG孵育样品过夜，随后通过低速离心或过滤即可沉淀回收外泌体。

但该方法也存在一些问题：比如外泌体的纯度和回收率低，存在假阳性（杂蛋白较多或一些难以去除的聚合物），机械力或化学添加物对外泌体产生破坏等。

而另一种方法是，如果你已知外泌体的糖链组成，可用凝集素来富集外泌体。凝集素是一种可与碳水化合物结合的蛋白质，在凝集外泌体后低速离心即可。而近年来，基于沉淀的原理来分离外泌体，市场上也研发各种商业化的外泌体提取试剂盒，操作简单，无需超速离心，就可获得高纯度和高回收率的外泌体。

由于外泌体中富含蛋白质，且其表面具有很多特异性标志性受体，如CD9，CD81，CD63，CD82，Hsp70，Ras相关蛋白Rab-5b，细胞骨架蛋白肌动蛋白和TSG101，因而可用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体共同孵育后，即可捕获它们。

又因为外泌体的异质性与它们的起源相一致，所以在不同的外泌体上的这些标记物的丰度也是不同的。因此，你可以通过特定的抗体组合从样本中捕获不同类型的外泌体，在将这些抗体固定在ELISA平板、磁性或层析珠上、又或者微流体装置上，来对外泌体进行选择性分离。

虽然免疫亲和技术具有高特异性、可获得高纯度的外泌体、且不影响外泌体形态完整等优点，是富集表征独特的外泌体的优选方法。但是此方法效率低，外泌体内含物的生物活性易受PH和盐浓度影响，不利于下游实验的进行。

至于外泌体到手之后，要如何发光发热来点亮大家的科研之路，以下这三个外泌体研究数据库或可助大家一臂之力。

网址：

http://microvesicles.org/index.html

该数据库不仅收录了外泌体（exosome）的中的分子信息，还有microparticles，Nanovesicles，Apoptotic bodies等囊泡类型的信息，并收录了过去几年发表的341个独立研究的35264个蛋白，18718个mRNA，1772个miRNA、342个脂质信息。凭借此数据库中，可以搜索出相关细胞囊泡在细胞间通讯、发病机制、药物、疫苗和基因载体传递等过程中所发挥的作用。

网址：

http://exocarta.org/index.html

相比于收录了其他囊泡信息的Vesiclepedia数据库而言，ExoCarta数据库只收录了外泌体中的分子信息。

ExoCarta数据库作为一个开放的平台，收录了人、大鼠、小鼠、绵羊、豚鼠、果蝇、马、穴兔、牛在内的几个物种的286个研究结果；涉及到不同组织器官来源的外泌体中的蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息，该数据库已经被超过16000名独立研究人员使用，最新更新时间为2016年09月12日。

网址：

http://student4.postech.ac.kr/evpedia2_xe/xe/

该数据库是由韩国项浦大学创建，并于2012年1月27日发布的。其包含高通量研究168例、高通量数据263个、分子数据172080个、文献6879篇；汇总了不同囊泡研究（包括外泌体）中发现的蛋白、mRNA、miRNA、脂类、代谢产物等。

除此之外，数据库还提供一些分析工具（Analysis），可用于如检索和浏览囊泡成分、Gene Ontology富集分析、囊泡蛋白和mRNA的网络分析，同时胞外囊泡研究的相关文献也在本数据库中列出。还可以看到囊泡表面标志物，如蛋白、RNA等。其最新更新时间为2017年07月31日。

参考文献：

1. Progress in Exosome Isolation Techniques（doi: 10.7150/thno.18133）

2. https://bitesizebio.com/37981/beginners-guide-hunting-exosomes/