创新临床微生物检验技术的思考

摘要:  回顾临床微生物检验技术的发展历程,明确不断创新是推动其进步的巨大动力. 结合个人从事临床微生物检验60余年的经验教训说明我国此学科的技术创新要基于传统技术，结合实际建立适宜技术。就此提出5点想法.

关键词:  临床微生物学  检验技术  创新发展

[Abstract]  Reviewed the historical journey of the developmens of clinical laboratory technics, definited the continuing innovation is the great pushing power. Combined over 60years personal experirens made clear that the innovation should based on the traditional technics, on the practical condition to set the suitable technics. 5 suggestions were put out for that.

[Key words]   Clinical Microbiology    Laboratory technics   Innovative development

临床微生物检验技术发展经历了百余年的历程,它吸取了自然科学研究的最新成果,经过无数前人的创新,新技术不断涌现,革新取得了极大的成就[1]. 在今天,我们回顾其创新发展历程,正视我们的不足而加强创新意识,增强创新能力,对促进我国临床微生物检验的创新发展,奋力赶超国际先进水平有着重大意义..

一. 临床微生物检验技术变革的动力--创新发展.

回顾临床微生物检验的发展历程,大体上经历了4个发展阶段:

(一) 传统微生物检验技术发展阶段。依靠显微镜和染色技术发展起来的形态学检验和传统的细菌培养技术发展起来的的细菌鉴定技术日臻完善。自患者的各类标本中分离培养病原菌，依细菌的形态和染色特征、菌落形态、生化反应、菌体抗原结构形成一系列的分离培养和鉴定手段，构成了经典的细菌诊断学。此阶段的病毒检验技术还不能普及。支原体、衣原体、螺旋体、立克次体（四体）的检验技术在起步阶段。

(二) 诊断微生物学检验技术发展阶段。细菌鉴定出现了成套鉴定装置（数码鉴定）和半自动细菌鉴定技术使细菌鉴定系统化。随后发展起来的多种自动化的细菌鉴定和药敏分析仪，其基本原理仍是依据细菌的生长和生化反应。只是检测细菌的酶反应底物不断改进，提高了鉴定的可靠性，且使鉴定所需时间有所减少。此阶段大量吸收了免疫学技术的进步，包括传统免疫技术、标记免疫分析技术（放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫等）形成”诊断微生物学”技术.

(三) 分子微生物学检验技术发展阶段。上述两阶段所用的技术是依据微生物的表型特征；而分子结构是其内在本质特征。分子诊断技术所依据的是微生物的分子结构和特征。创新的分子技术的兴起，使微生物的检出、鉴定、新病原体的发现，微生物致病因素和耐药机理的研究、菌株的分型和流行病学等均发展到分子水平。

1. 代表性的技术是在传统聚合酶链反应（PCR）的各种新型的PCR技术用于微生物的快速鉴定与分型，在常规PCR技术基础上又发展了恒温核酸扩增技术，多重PCR，实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR），）RT-PCR扩增产物的熔解曲线分析等，使微生物诊断进入快速发展的新阶段。

2. 与质谱分析技术相结合的分子生物学技术是近年来微生物鉴定技术的一大进展。质谱技术分析微生物成分已用于培养标本的检测来鉴定微生物并进行分型、还可用于耐药基因和致病机理的检测等。基本的检测方式有用培养的微生物进行GC-MS来检测脂肪酸、多糖组分等进行鉴定。最引人注目的进展是基质辅助激光解吸飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）检测细菌的组成分子（氨基酸、多肽、类脂、蛋白质等）进行鉴定。所用的仪器和分析鉴定用软件已在国内、外应用和推广，已成为最重要和可靠的微生物鉴定手段。另外，用变性高压液相质谱（dHPLC）进行细菌分型和细菌耐药酶的鉴定与分型。用血清蛋白质组分析技术（Serological proteome analysis,SERPA）来鉴定一些难以培养成功的新病原体（如Whipple’s病的病原体）等。正在发展中的还有双相液相色谱SERPA技术。

3. 在此基础上发展了分子流行病学技术。用来确定感染的流行菌（毒）株和医院感染的流行株，常用的技术有：1. PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)。2. PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)。3. PCR-随机扩增多态性分析(PCR-RAPD)。4. 基因重复序列的PCR分析(Rep-PCR)。5. PCR-线性探针分析(PCR-LINE)。6. 多位点序列分型（MLST）。7. 质粒DNA酶切指纹图谱分析。以上方法各有其优越性和局限性。

(四) 基因微生物学检验技术阶段。由于微生物的一切性状都是由其基因决定的。因此，基因诊断技术就更加体现了微生物的本质特征。基因检测技术已彻底改变了并将继续改变着临床微生物学和微生物检验的面貌[2]。微生物基因测序技术。已是鉴别微生物的决定性方法，但因仪器昂贵、技术相对复杂而不能常规应用。目前，基因和核苷酸多态性（SNP）的测序技术几经改进，发展迅速,多种新型自动测序仪相继出现。许多微生物的全部序列已经确定。新一代的全基因组的测序仪可在数小时内完成,现用于微生物诊断的测序技术有：微生物的16S rRNA基因序列分析。16S rRNA是公认的原核生物分类鉴定的标准。18S rRNA基因序列适用于真菌的鉴定分型,还有焦磷酸测序, SNP测序等。基因芯片（DNA微阵列）和液相芯片技术. 研究群体微生物学的宏基因组学(Metagenomics). 以及自血浆中扩增游离DNA技术诊断菌血症等。其他尚有纳米生物技术,生物传感器技术等相应而生。

由以上简述的微生物检验技术的发展历程雄辩地说明,不断地创新是促进其发展的强大动力. 通过不断创新才有今天的微生物检验的进步.[3]

二. 我国临床微生物检验技术滞后的关键在于创新力不足.

我从事临床微生物检验技术工作已60余年,亲历了其发展的各阶段. 从开始接触到的就是外国人创建的技术和名词,如革兰氏染色,大肠埃希氏菌,伤寒沙门氏菌,瓦氏(Wasserman)反应,康氏(Kang)反应等. 检验操作要严守外国人制定的操作规程,认为不越雷池一步是最好的职业操守. 逐步形成了思想僵化,不愿变革的习惯, 但内心里还是有强烈的愿望改变现状,梦想着能有我们自己的技术也能得到外国人认可,使我们的技术也在世界上占有一席之地. 我也曾努力钻研技术,注意总结自己的心得体会; 也曾热情投入"大跃进""放卫星"洪流中,做过一些脱离实际,违反科学的错事.个人60多年的工作实践,尽管不吝付出,积极向上,也写过不少文章,参与编写过几册著作. 但自问有什么创新技术问世吗? 茫然!

我想,我个人的经历也许就是国内大多数从业者的缩影。所以,我国的临床微生物检验依然滞后, 且不讲我国的贫困和欠发达地区尚不能运用新技术;即使是在大的医疗或疾控机构也以运用外国的仪器和方法为主。就检验医学整体来讲也是如此. 在全国医学专业中,我们检验医学的科研课题立项和专利申请量都是较低的。创新意识不足,创新教育缺位,创新能力低下,成为我们技术滞后的关键问题。

三. 抓住机遇, 大力促进临床微生物检验技术的创新发展

当前党中央倡导“大众创业、万众创新”，正是技术创新的大好时期，我们要抓住机遇趁势而上，大力创新技术。怎样实现技术的创新呢？管见所及，提出几个方面的建议供大家参考：

(一)培养、树立和增强创新意识.

我们做技术工作的要务在于技术创新。创新是充分运用和掌握前人技术成果的基础上不断有所发现有所创新和创造，但这不是无科学依据的异想天开。创新要不断钻研本领域先进理论，依据科学规律来改革。关键在于要有强烈的、正确的创新意识，善于发现现有技术的不足而改善之。创新之事绝非一蹴而就，要培养和积累创新能力，要从大处着眼，小处着手，才能积小革新为大创新。

(二)微生物检验科(室) 是技术创新的主阵地

科学研究一向以实验室为主要基地，实验室技术的创新历来带动着科学的进步，检验着科学假说的正误，不断推动着科学的发展。事实上，我国在微生物检验方面的成就也是依靠实验室完成的。如在建国初期，中科院微生物研究所和北京同仁医院的汤非凡教授用鸡胚培养技术首先发现了沙眼病毒（后被证实为沙眼衣原体），而在国际上获奖。而固守已有观念，缺乏创新意识，可能贻误重大发现的良机。如上世纪70至80年代，我国胃病专家在电子显微镜下自患者肠粘膜中发现了细菌，同时北京的专家发现口服呋喃唑酮（痢特灵）治疗消化道溃疡有肯定的疗效，可惜的是，由于确信胃酸过多是胃溃疡的病因; 且在高胃酸下，细菌无法存活，而忽视了实验室的发现和临床证据，痛失了发现幽门螺杆菌（HP）的机会[4] 。后来，澳大利亚的Waren Marshall证实了HP的存在，且口服HP菌液证实其致病性。此项成就在2005年获得诺贝尔生理学或医学奖。如此深刻的教训提醒我们必须重视实验室的发现，依据线索深究根源，不能固守已有观念。我们处在临床检验一线，每天接触众多的临床标本和数据，理应有新发现的好机会，如果我们缺乏发现问题解决问题的自觉性，缺乏创新意识，就会使许多创新机遇在自己眼前流失。

令人高兴的是最近几年国内不乏创新结果出现。如SARS在我国局部地区的流行极大推动了对新病原体和再现病原体的检验技术的发展，对流感病毒H7N9、H1N1,登革热，Ebola病毒等的检测技术,说明在微生物实验室是可大有作为的。

(三)从实际出发，在传统技术基础上发展适宜技术。

创新要从实际出发，从切实可行的条件出发，不能好高骛远，不能浮躁取巧。必须承认，目前国内大多数微生物实验室还不具备质谱，分子和基因检测的技术手段。有当然好，没有也不等于不能做好检验工作和技术创新。我同意发展和提倡适宜技术，即适合国情和适合自己条件的技术，如微生物检验传统技术中的细菌培养技术，细菌形态学和菌落形态学技术仍是检验的基本功，不能忽视，要牢牢掌握，且促其发展。如果连革兰染色技巧都掌握不好，就失去细菌鉴定的基础；即使有了MALDI_TOF_MS鉴定手段，但缺乏辨认菌落形态的基本功，所选定的待鉴定菌落错误，其结果肯定错误。现在忽视基本功的倾向必须纠正。试想，如果依据细菌和菌落的典型形态和色素生成就能鉴定出铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌，何需再用复杂而昂贵的分子和基因技术呢？适宜技术绝不排斥分子、基因诊断技术，关键在于运用恰到好处。

(四)发挥团队精神，联合一切可用的力量

在先进技术飞速发展的今天，创新已不能靠单打独斗完成，科研创新团队是创新中攻坚克难的最佳组织形式。我们如有创新的想法和苗头而实现条件又不足，就应该去找外援协作，包括科研机构、大学、业内专家、厂家企业等一切可用的力量，共同合作分享成果，这是由无数成功例证所证明的成熟经验。从玉隆主任主张“产、学、研、用”联合发展大检验医学，这也完全适用于创新发展检验技术。

(五)创新独具中国特色的检验技术

这是最具艰巨性的任务，最有挑战性的梦想。记得数年前，在一次关于细菌耐药性检验的研讨会下，我和陈民鈞教授感慨何时我们能有自己的药敏折点判定标准。现在我们应用CLSI的判定标准并非完全合适，因为我国的流行感染菌株，临床应用抗菌药物的品种和用量均与美国不完全相同，加之人种差异，迫切需要制定适合我国特点的标准。另人高兴的是，我国已建立了组织来此事此项工作，这将是意义重大的创新，有了它，我设想的实现个体化药敏试验报告的想法[5] 也就有了实现的基本条件。

我国的细菌药敏试验不能忽略了中药，对于中药单药的药敏试验前人做了许多尝试，药效大多不满意。不久前，我看到中药煎剂的抑菌试验，其技术的完善、判定标准的制定更是路漫漫其修远，需要长期上下而求索。这方面,寄希望于我国中西医结合学会检验医学专业委员会. 当然，需要我们创新的具有中国特色的项目绝非仅此两例。

上述想法也是我的梦想。我如今已年逾八十。回顾一生从事微生物检验憾事颇多。由于年老体衰已无力弥补，只有寄希望于后来人来实现我的梦想。殷切希望寄于笔端，望有益于读者。

参考文献：

[1] 王金良. 新传染病的快速诊断要求发展微生物检验新技术. 实用检验医学杂志, 2009,1:2-5

[2] S.W.Long, D.Williams, C. Valson et al. A genomic day in the light of a clinical microbiology laboratory. Clin Chem. 2013,59(2):335-33

[3] Nader Rafai. Advancing laboratory medicine through innovation: A tale of innovators. Clin Chem 2012,58(3):502-510

[4] 刘端琦。一个细菌，多重启迪。中国肿瘤临床，2013，40（1）：1-2

[5] 王金良。药敏试验的更高目标—个体化药敏试验报告。中华医学检验杂志。2012，35（8）：764-765