浅析三类ctDNA检测技术的特点

2016年11月国家卫生计生委临床检验中心（以下简称“临检中心”）发布了2016年全国肿瘤游离DNA（ctDNA）基因突变检测室间质量评价调查活动结果报告。参加本次质评的74家实验室回报的方法学包括数字PCR、新一代测序（NGS）与ARMS，临检中心针对发放的10个血浆游离DNA样本的回报结果进行评价。

　　从质评结果看（表1，2），数字PCR是目前ctDNA检测最稳定的技术，合格率达100%，假阴性为0，假阳性也是最低的，非常适合临床推广普及；NGS方法能同时检测多个基因的多种变异，但是各个实验室的结果差异最大，对实验操作流程及数据处理的要求最高，在临床推广时标准化显得尤其重要。

表1 三类ctDNA检测方法总体质评结果（合格率、假阴性、假阳性）及三类方法的技术特点

表2 10个质评样本采用三类技术方法的检测情况（符合率，假阳性，假阴性），绿色表示无假阳性或无假阴性

　　1、数字PCR

　　数字PCR是三类方法中最新的一种技术，本次质评仅有11家采用此方法，但合格率达到100%，没有一家实验室报出假阴性结果，只有3个样本报出假阳性结果。说明这种方法相对最稳定，而且易于掌握、准确度高，特别适合ctDNA检测及临床推广。虽然数字PCR与ARMS都是单次检测单个基因的单个变异，但是其灵敏度高于ARMS，更适合液体活检。相比NGS，同时检测多个基因的多种变异时，数字PCR会有劣势，但是只需检测单个变异位点时，就具备操作简单、成本低廉的优势。

　　2、新一代测序技术（NGS）

　　NGS能同时检测多个基因的多种不同变异形式，是目前国内最热门的基因检测技术，参加本次质评采用NGS方法的实验室最多，共有43家。虽然本次质评只对等位基因百分比高于0.5%的突变予以评价，并未将检测下限设定至许多公司宣传的0.1%甚至更低，但是合格的实验室只有34家，其中拿到满分的仅17家，另外还有9家不合格，甚至6家得了0分。

　　从10个参评样本结果来看（表1，2），每个样本都有部分实验室报出假阳性结果（100%），报出假阴性结果的样本有5个（50%）；另外各个实验室报告的突变等位基因百分比完全没有可比性，说明NGS方法是相对最难稳定与掌握的技术。

　　由于NGS整个实验流程相比ARMS与数字PCR更为复杂，因此对结果产生干扰的因素也会更多，导至各个实验室的回报结果差异最大，因此要普及NGS检测ctDNA技术需要对实验操作流程与数据处理以及标准化提出更高的要求。

　　3、ARMSPCR

　　ARMS方法具有操作简单、成本低廉的优势，在病理组织分子检测中已被广泛应用，是目前三类方法中临床接受度最高的技术。本次质评共有14家实验室采用ARMS，其中10家获得满分，3家不及格。报出假阴性结果的样本有2个，其灵敏度不及数字PCR；报出假阳性结果的样本有7个，说明其稳定性也欠佳。因此在液体活检领域，数字PCR相比ARMS更具临床应用潜力。

表3 各实验室ctDNA检测PT成绩情况

　　另外本次质评仅对肿瘤游离DNA检测的质量进行实验室间比对，并未涵盖核酸提取过程。其实血浆游离DNA的提取对肿瘤游离DNA检测非常重要，由于DNA片段化，不同的提取试剂对小片段DNA的结合效率差别很大，导至游离DNA的提取效率存在很大差异，实验室应对提取效率进行充分评价。