郭玮教授《液体活检在结直肠癌诊疗中的应用》导读

卢仁泉：各位观众朋友，大家好！欢迎来到《中华检验医学杂志》“专家论坛”导读。我是主持人复旦大学附属肿瘤医院检验科的卢仁泉。即将在《中华检验医学杂志》发表的《液体活检在结直肠癌诊疗中的应用》一文，为我们讲述了当下热点，液体活检的技术特点及其在结直肠癌诊疗中的临床应用前景。为了更好地学习并深入理解，今天我们有幸邀请到了该文的通讯作者—复旦大学附属中山医院检验科副主任 -郭玮教授来到访谈现场，为我们答疑解惑。

郭玮：观众朋友们大家好，很高兴来到现场和大家交流学习液体活检的热点话题。

卢仁泉：郭主任，近年来液体活检作为2015年十大突破技术之一，在临床崭露出很好的发展前景与潜力。液体活检具有取材方便、创伤小、便于重复、实时动态监测等优点，使其在“精准医疗”工作中备受关注。液体活检中的外泌体研究最近非常热门，但是真正进入临床的是循环肿瘤细胞（CTCs）和循环肿瘤DNA （ctDNA）。首先，请您给我们介绍一下液体活检在肿瘤精准诊疗临床当中的应用优势以及应用前景？

郭玮：我们今天就来讨论一下目前在临床应用比较广泛、比较前沿的CTCs和ctDNA。您刚刚提到的液体活检中的CTCs和ctDNA定义就是从肿瘤原发灶或转移灶脱落并释放到外周血循环系统的肿瘤细胞和DNA片段，携带了肿瘤的不同时间段的信息或者说反应了肿瘤某一个时间点的全貌。

越来越多的研究证明肿瘤的特点是高度异质性和不断进化。肿瘤的异质性体现在多方面，主要包括：同一肿瘤内的不同区域的空间异质性，或者是同一患者的原发瘤及其复发灶和转移灶之间的差异（时间异质性），还有功能异质性和治疗异质性等。针对肿瘤的这种时空异质性和动态变化的特性，就需要我们用新技术、新理念去看待肿瘤。液体活检能够灵敏检测到低丰度突变，多点实时采样可以掌握肿瘤发展不同阶段的全景，还原肿瘤发生发展的进化树。正是液体活检的这种优势使它在肿瘤精准医疗的应用包括：结合组织标本挖掘驱动基因，进一步完善驱动基因谱；定量实时监测肿瘤动态变化进行靶向治疗；通过绘制靶向治疗过程中耐药“进化树”，实现对新耐药基因的预防和研发。总之，液体活检真正迈向临床实践还有无限的可能。

卢仁泉：我们知道，CTCs的研究与应用起步早于ctDNA和外泌体。大量研究报道CTCs的数量和表面标志物与肿瘤的转移与复发预估等密切相关，早在2004年美国FDA已批准CellSearch用于评价转移性乳腺癌、前列腺癌、转移性结直肠癌患者的预后，并于2012年获得cFDA的批准。但目前看来，其应用受到某些限制。可否谈谈当前CTCs在临床应用中遇到的瓶颈问题？

郭玮：确实，CTCs是最早应用于临床的液体活检技术，目前主要的应用是通过其数量和部分分子标志物进行肿瘤疗效观测、预后判断、复发风险评估。

CTCs的特性在于数量稀少，而且具有时空异质性。基于这两点特性在临床实际应用中的挑战还是体现在：抓得到，抓得准，也就是捕获效率。虽然市场上有多种不同的CTCs分离捕获平台，包括物理性质的密度梯度离心、膜过滤、介电电泳等，或基于免疫学特征的CD45阴性富集和特定分子标志物阳性富集等技术，但各自存在局限性。

CTCs数量以及个别分子标志物的检测已无法满足临床精准医疗的需求，临床应用希望更深入了解和挖掘CTCs的分子特性。相关的研究包括：（1）对CTC簇的关注，比起单个CTC细胞的分子特性，更关注CTC簇的干性、侵袭性。（2）对CTCs捕获、培养、再进行单细胞测序、转录组及蛋白组等基础研究;（3）进行体外培养，建立PDTX药敏模型，指导临床用药决策；（4）还有研究发现CTC不仅会扩散转移，也会回到原发肿瘤处，这种特性我们称为“归巢”，可以利用CTCs归巢的特性设计新的治疗干预方式。

对CTC的分子特性的更深入的研究更有利于我们更深入的了解肿瘤的进化。与其说CTCs发展停滞或临床应用受到质疑，不如说CTCs正在等待更深入的临床研究，为精准诊疗发挥更大的作用。

卢仁泉：众所周知，结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤。随着人们经济水平、饮食结构、生活方式的改变，我国结直肠癌发病率逐年攀升，已经成为第三大常见肿瘤。液体活检之前在非小细胞肺癌临床工作中已有较好的应用，那在结直肠癌的靶向治疗中，其又有哪些可借鉴之处呢？

郭玮：液体活检和分子检测技术的进步无疑推动了肿瘤靶向治疗向纵深方向发展。目前而言，大部分肿瘤中仍未检测到明确的驱动基因，因此对这类肿瘤仍选择细胞毒性化疗。对于具有已知驱动基因的非小细胞肺癌，有较多的靶向药物，利用液体活检进行分子分型用药指导已经获得了很好的临床效益，尤其是以ctDNA突变检测的应用较为成熟。2014—2015年间，国内外相关机构和临床专家都一致认为提出液体活检完全可以作为组织活检的补充。2016年在欧洲肺癌大会上更是有专家提出对已知耐药位点的靶向治疗中可以无需组织活检，建议直接以ctDNA突变检测结果调整用药。结直肠癌是一组异质性疾病，患者的RAS基因状态可以作为EGFR单抗靶向药物的疗效的预测指标，因此结直肠癌的治疗也进入了分子分型的靶向治疗时代。自2015年起美国《国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》指南指出转移性结直肠癌患者在制定抗EGFRs靶向治疗方案前应进行KRAS和NRAS的突变检测来指导临床用药方案的选择。检测BRAF突变可作为有效的预后指标。结直肠癌的治疗完全可以吸取液体活检在非小细胞肺癌靶向治疗中应用的经验，将血液检测和组织检测紧密结合起来，进行更多的临床试验，更多的临床转化，推动液体活检在结直肠癌靶向治疗的进一步发展。

卢仁泉：正如您所言，NCCN已经明确指出检测KRAS和NRAS基因的热点突变可用于结直肠癌靶向治疗决策中；那当前可用于检测ctDNA突变的平台有哪些，您是否可以概括下各自的特点呢?

郭玮：目前用于检测外周血ctDNA突变的主要的平台包括：ARMS、数字PCR和BEAMing以及NGS。ARMS方法简便快捷、普适性高、有成熟的试剂盒，适合大多数医院开展,可同时覆盖多种突变。但是它无法定量检测突变基因的丰度，灵敏度也不足，容易漏检低丰度突变。数字PCR技术和BEAMing可以对靶基因进行绝对定量检测。这类方法的检测灵敏度是目前最高的。我们的研究尝试在200 000多个野生型拷贝中可以检测到20个拷贝的突变型基因，灵敏度达到0.01%。多项转移性结直肠癌的靶向治疗的临床试验都采用BEAMing 技术平台。但是这类方法也有缺点，仅能用于检测已知位点，通量相对较低。NGS是目前的最大的热点，它通量高，可定量检测多个已知或未知的突变基因。NGS更适合肿瘤靶向治疗中多基因位点检测的需求。NCCN等各种指南中都对 NGS的临床应用作了推荐。当然，NGS在临床实际应用中对人员和操作要求相当高，比如：DNA的富集与建库方法、选择合适的测序平台、生物信息学分析、数据解读等方面都存在诸多技术难点，需要较高要求的人力储备、规范化管理和标准化操作。

总之，现有ctDNA检测平台各有优缺点，我们应该从临床需求出发结合检测平台特性，对检测结果的假阳性和假阴性进行平衡与取舍，对有临床意义、对科学进展有利的位点进行探索，使患者能得到规范而谨慎的“精准治疗”。

卢仁泉：晚期结直肠癌患者的组织活检标本获取困难，重复取样就更为困难。随着检测技术的发展，液体活检的作用越来越大，引发大家的关注和重视。ctDNA突变检测与组织活检的关系如何，会不会出现不一致呢？

郭玮：近年来大家一直关注ctDNA与组织检测结果一致性的问题。随着技术的不断进步，血液检测的结果与组织检测结果的一致性越来越高。各种临床试验的数据显示，ctDNA检测和组织的一致性都在80%以上甚至更高。我们也做了相关一致性的研究，在结直肠癌患者中，使用数字PCR检测外周血中KRAS和NRAS突变与组织突变结果的符合率达到85%，与国外的报道是比较一致的。

卢仁泉：您认为两种检测方法的结果出现不一致的原因又有哪些？ 

郭玮：ctDNA与组织检测结果存在不一致，需要我们仔细分析原因。归纳起来有以下几方面因素：（1）标本本身各有局限性。组织标本受限于取材部位会有漏检的情况，而ctDNA也有微量、片段化和半衰期、以及标本的储存和运输等问题（2）技术的原因主要有模板抽提效率和数据分析平台等因素。模版抽提效率直接影响实验的成败，一般若无法大量富集200 bp以下的片段，可能会导至结果假阴性甚至无法分析。生物信息分析过程中的参数不同会影响到最终结果的数据处理和变异过滤。（3）方法学的差异。不同方法各有特点，敏感性不同、检测基因数量不同也会造成结果的不一致。（4）患者肿瘤病理分期不同以及治疗前后等情况也会有不同的检测结果，比如特定治疗干预后会导至ctDNA的水平显著变化。

在我们的研究中，曾发现1例患者的原发灶组织中某个基因突变检测结果阴性，外周血ctDNA该基因检测结果却为阳性，而我们同时在转移病灶组织中检测到了与外周血相同的阳性突变。这个案例证实了外周血ctDNA突变检测更能反映肿瘤全貌。总之，液体活检步入临床还需要更多的临床实践和经验积累，现阶段我们应该结合液体活检与组织活检进行科学分析。液体活检一定是未来的发展方向。

卢仁泉：医学检验实验室也常采用自建的检测方法（也就是LDT），LDT是指实验室自行研发、验证并使用的检测方法，通常仅在研发实验室内部使用，不作为商品出售给其它医学检验实验室、医院及个人。近年来，随着检测技术不断进步，新方法、新项目从研发快速转化到临床应用；再加上个体化医疗的需求，大部分液体活检平台会用到LDT，如何更好地使其规范并应用于临床中呢？

郭玮：液体活检和分子检测技术近年来确实有了蓬勃的发展，这有利于精准的诊断、治疗、甚至于疾病的风险预测，比如NGS的应用。这些检测方法离不开LDT。国外的情况是，在美国LDT有明确监管定义，在欧洲和日本并没有明确进行监管。我国医学检验部门开展的LDT无论是数量和种类都落后于欧美发达国家。而我国目前对检验项目的注册审批制度以及收费制度都很大程度上影响LDT的临床应用和发展。在2017年《中华检验医学杂志》第3期上，中华医学会检验医学分会发表了《我国医学检验部门自建检测方法发展与管理的建议》，提出如果对我国医学检验部门的LDT实现逐步放开适度管理，将可大大推进医学检验部门新方法、新技术的应用和发展。我们对LDT进行科学监管的新思路新模式应该是：提倡创新和发展，促进创新和发展，在发展中进行科学合理的监管。在放开的同时我们也要认识到：LDT检测结果错误或结果解读不正确，将带来临床决策的错误和伴随的风险。因此在科学积极的开展LDT的同时，对医学检验部门将面临更大的挑战。对医学检验自身，要加强自我管理；对临床来说，要加强与临床医生的密切合作；对患者而言，切实做好患者的知情同意工作。因此，我们应该正确认识、界定和规范LDT，这是检验医学发展的前提和保障。

鉴于液体活检在精准诊疗中将发挥越来越大的作用，LDT科学合理的管理模式会有利于它的科学发展。

液体活检正经历从单基因到多基因、从定性到定量、从静态到动态的变革，推动着精准医疗的发展，必将引领肿瘤研究和相关临床实践进入一个全新的时代。

卢仁泉：非常感谢郭主任为我们耐心解答了这么多液体活检在临床应用中的问题，让我们对液体活检在结直肠癌在临床中的应用和发展前景也充满了希望。再一次谢谢郭主任！

如果大家还想进一步了解液体活检在结直肠癌中的详细内容，请大家阅读2017年第四期本刊的“专家论坛”栏目《液体活检在结直肠癌诊疗中的应用》一文。

专家简介

郭玮，女，复旦大学附属中山医院检验科副主任。博士、博士生导师。《中华检验医学杂志》审稿专家。

中华医学会检验医学分会第九届委员会青年委员会委员、生化学组成员，上海市医学会检验医学分会第十届委员会委员、质谱学组组长，上海市抗癌协会检验医学专业委员会副主任委员、《检验医学》等多本杂志编委。

近年来主持国家自然科学基金、癌变与侵袭原理教育部重点实验室开放课题基金、上海市科委基金、上海市卫生局基金多项；参与国家科技重大专项课题、“十二五”国家科技支撑计划子课题、卫生部医政司课题、国家自然科学基金，曾获上海市医学科技奖二等奖，发明专利两项。在国内外统计源期刊发表论文70余篇，主编、参编专著7部。以第一作者或通讯作者在Clinical Cancer Research、BMC Cancer、Clinica Chimica Acta、CCLM等杂志上发表液体活检或肿瘤标志物临床应用的多篇研究论著。

电子信箱：guo.wei@zs-hospital.sh.cn

卢仁泉，男，博士，副教授，复旦大学硕士研究生导师。复旦大学上海医学院肿瘤学系/复旦大学附属肿瘤医院，主任助理。

担任上海市抗癌协会检验医学专业委员会副主任委员、上海市抗癌协会实体肿瘤聚焦诊疗专业委员会常委、上海市中医药学会检验医学委员、上海市免疫学会肿瘤免疫委员、中华医学会上海检验分会青年委员、上海市分子诊断专科分会青年委员、中华医学会上海检验分会分子生物学组秘书、中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会专业会员等。2013年，入选上海市浦江人才计划；主持国家自然科学基金、上海市科委、市卫计委、市教委等课题近10项；参与国家基础研究计划“973”子课题等多项课题；申请国家发明专利3项；获上海市优秀发明奖银奖1次、铜奖2次、获上海市抗癌协会科技奖三等奖1次、获上海市医学会检验分会优秀科研成绩一等奖等；多次应邀在国际会议GAP、WIN、IGIC等上作报告。

电子信箱：lurenquan@126.com