核糖核苷酸是RNA的基本单位，它们会在DNA复制和修复过程中嵌入基因组DNA，进而影响基因组的稳定性。然而，迄今为止人们还无法鉴定和定位这些插入DNA的核糖核苷酸。 为此，乔治亚理工学院和科罗拉多大学的科学家们开发了一种新测序技术，Ribose-seq。该技术可以鉴定和分析插入基因组DNA的核糖核苷酸，适用于包括人类在内的多种生物。这一成果发表在一月二十六日的Nature Methods杂志上。 研究人员利用这一技术在酿酒酵母的细胞核和线粒体DNA中，绘制了核糖核苷酸的完全图谱，鉴定了核糖核苷酸插入的“热点”区域。研究显示，核糖核苷酸嵌入很普遍但并不是随机发生的。 “核糖核苷酸是DNA中丰度最高的非标准核苷酸，但迄今为止人们还无法确定它们的位置和类别，”乔治亚理工学院的副教授Francesca Storici说，他与科罗拉多大学的助理教授Jay Hesselberth共同领导了这项研究。“核糖核苷酸插入会改变DNA的结构和功能。” 核糖核苷酸里的羟基（OH）能使DNA发生扭曲，形成敏感性位点。值得注意的是，OH和碱性溶液之间的反应，会让DNA更容易被切割。Ribose-seq就是利用这一反应来检测核糖核苷酸插入事件的。 研究人员先在核糖核苷酸处切割DNA，然后在此基础上构建DNA文库，文库中的DNA序列包含核糖核苷酸插入位点及其上游序列。随后，他们对文库进行高通量测序，将测序读取与参考基因组进行比对，最终获得rNMP插入事件的基因组图谱。 “Ribose-seq能够特异性直接捕捉嵌入DNA的核糖核苷酸，”Storici指出。“这一技术适用于任何基因组DNA（从细胞核基因组、质粒DNA到线粒体DNA），不需要进行标准化。Ribose-seq还可以在DNA遭遇环境压力发生断裂和脱碱基时分析rNMP。” 核糖核苷酸里的羟基是ribose-seq的关键，“OH是核糖核苷酸特有的”文章的第一作者Kyung Duk Koh说。 研究人员在酿酒酵母中对这一方法进行了验证。“不论是核糖核苷酸的插入位点，还是核糖核苷酸的组成都存在偏好，”Koh说。“我们找到了核糖核苷酸插入基因组的一些热点。”人们可以在此基础上鉴定不稳定的基因组区域，理解它们对DNA性能和活性的影响。 下一步，研究人员将把ribose-seq用于其它DNA，“这一技术可以用于任何生物的任何细胞类型，只要能提取出基因组DNA，”Koh说。 除了DNA修复和复制以外，药物、环境压力和其它因子造成的损伤也会使核糖核苷酸插入DNA。而Ribose-seq可以帮助人们研究这些过程产生的影响。 “Ribose-seq能让我们更好的理解核糖核苷酸对DNA结构和功能的影响，”Storici说。“鉴定特征性的核糖核苷酸插入，可以找到人类疾病的新生物学指标，比如癌症和退行性疾病。” 参考文献：
Ribose-seq：global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA Kyung Duk Koh， Sathya Balachander， Jay R Hesselberth， & Francesca Storici， Abundant ribonucleotide incorporation in DNA during replication and repair has profound consequences for genome stability， but the global distribution of ribonucleotide incorporation is unknown. We developed ribose-seq， a method for capturing unique products generated by alkaline cleavage of DNA at embedded ribonucleotides. High-throughput sequencing of these fragments in DNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae revealed widespread ribonucleotide distribution， with a strong preference for cytidine and guanosine， and identified hotspots of ribonucleotide incorporation in nuclear and mitochondrial DNA. Ribonucleotides were primarily incorporated on the newly synthesized leading strand of nuclear DNA and were present upstream of (G+C)-rich tracts in the mitochondrial genome. Ribose-seq is a powerful tool for the systematic profiling of ribonucleotide incorporation in genomic DNA |
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