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[分享] 干货分享 | 尿液cfDNA的研究现状及样本准备方法总结

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发表于 2022-9-13 16:33 | 显示全部楼层 |阅读模式

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干货分享 | 尿液cfDNA的研究现状及样本准备方法总结
前言
随着液体活检在肿瘤领域中的应用越来越常态化,其中的明星成分“循环游离DNA(cfDNA)”也成为研究者口中的常客。虽说液体活检是检测包括血液、尿液等体液中的cfDNA,不过细心的老师们会发现血液cfDNA的研究数远超其它液体样本类型。以尿液样本为例,小编在NCBI上检索发现,血液cfDNA的相关成果大约是尿液的20倍。今天我们就一起来探讨一下这种现象背后的原因,以便更好地推进尿液样本中cfDNA的相关研究。
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液体活检相对应的是咱们大家所熟知的组织活检,但我们都知道组织活检首先需要获取组织样本。而组织样本的获取存在一定的困难,比如不能实时多次取样、有些患者因自身病情的限制无法获得组织样本,而且组织样本的获取过程会给患者带来很大的痛苦,甚至还有一些研究发现组织活检取样时可能会导至病灶转移等。这时就出现了液体活检,通过检测血液等体液样本中的物质来进行肿瘤的相关研究。体液样本获取的优势在于可以实时、多次取样,而且对患者造成的创伤很小或者是完全无创。
尿液cfDNA检测的优势及存在的问题
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相对于血液样本,尿液样本cfDNA的检测更有优势[2]。主要体现在尿液样本采集更方便,不需要专业人员的操作;尿液样本可以算是真正意义上的无创检测;尿液样本体积大,可以满足各种检测的样本量要求;可以实现多个时间点的纵向取样等。尿液cfDNA来源于肾等泌尿系统中的器官上皮细胞脱落及少量的白细胞等,其在患者中的含量高于健康人群,所以是研究泌尿系统癌症如膀胱癌、肾癌的理想选择。


虽然尿液样本存在这么多优势,但目前尿液cfDNA的检测以及成功应用却非常少。主要归因于以下几个方面:尿液的成分比较复杂,尤其是DNA酶的活性比血液中更高,所以更容易造成cfDNA的降解[3];尿液中存在大量的微生物,容易导至尿液样本失效;尿液样本cfDNA的半衰期是2.6-5.1个小时,cfDNA片段的降解程度更高;与血液样本相比,尿液中cfDNA的长度更短,且存在多个峰值,我们不能照搬血样cfDNA的检测方法;目前缺少标准化的尿液cfDNA样本的保存或者分析方法。所有这些都限制了尿液cfDNA的应用。
尿液cfDNA的研究进展
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诚然,尿液cfDNA的研究存在诸多挑战,但研究者们一直致力于解决这些问题,以便更好地将尿液样本应用到临床诊断中。目前在癌症早期诊断、泌尿系统肿瘤和肾移植后功能障碍监测方面都有应用成果发表,甚至在其它肿瘤中也有研究探索了尿液cfDNA检测的应用。在胰腺癌研究中,对健康对照、儿童患者和胰腺癌成年患者的血浆和尿液样本进行检测,结果发现健康人尿液cfDNA的片段化与患者之间存在差异,在某些区域患者样本比健康对照的片段化程度更高,且多位癌症患者cfDNA片段分布以及长度均相似 [3]。在神经胶质瘤患者中进行尿液cfDNA的检测,发现即便只得到微量的cfDNA,但也有可能发现致病突变。膀胱癌患者中,尤其是晚期患者的尿液cfDNA浓度要高于正常人群或者良性泌尿系统疾病的患者。在疾病复发监测方面,出现疾病进展的患者中尿液cfDNA的浓度更高。还有研究者在尿液cfDNA中寻找监测和鉴别移植肾脏损伤的标志物。除此之外,还有研究者开发了尿液cfDNA保存管,以及专门研究尿液cfDNA的方法,如UroSEEK和基于尿液的CAPPseq法。虽然目前很多研究都处于初步探讨阶段,但对尿液cfDNA的应用奠定了良好的基础。


尿液cfDNA样本的采集及保存方法
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目前还没有标准的尿液cfDNA的样本采集和保存方法,不过可以查到老牌streck有用于尿液cfDNA研究的样本保护液以及上文中提到的有研究者开发的尿液cfDNA保存管。另外,小编从事研发的小伙伴还使用过streck血液采集管尝试尿液样本的储存。由此可以看出尿液的保存方法可谓百花齐放,这里我们也整理了几种文献里用到的方法供大家参考。
1

2020年发表在Nat Med杂志上的题为Detection of renal cell carcinoma using plasma and urine cell-free DNA methylomes的研究中的方法:
将尿液样本收集在无菌尿液样本容器中,并在3小时内进行及时处理。2500g离心10分钟,将上清液按照1-2mL的规格进行分装并保存在-80度备用。后续提取cfDNA时使用的试剂盒是Qiagen genomic DNA extraction Kit,使用的尿液体积是2mL。
2

2021年发表在Sci Transl Med杂志上题为“Analysis of recurrently protected genomic regions in cell-free DNA found in urine”研究中的方法:
对收集完成后1小时内的尿液样本进行处理,向40mL尿液中加入0.8mL的0.5M的EDTA,并分装成10mL一份,随后1600g离心10分钟,并保存在-80度。使用MagMAX Cell-Free DNA Isolation试剂盒从10mL尿液中提取cfDNA。
3

2021年发表在EMBO Mol Med杂志上题为“Fragmentation patterns and personalized sequencing of cell-free DNA in urine and plasma of glioma patients”研究中的方法:
尿液样本采集完成后立即置于冰上,在收集后一小时内加入0.5M的EDTA,并在4度条件下1500g离心10分钟,收集上清液后20000g再次离心10分钟,随后按照2mL的标准进行分装并保存在-80度。使用全自动核酸提取仪QIAsymphony进行cfDNA的提取。
4
2021年发表在PLoS Med杂志上题为:“Urine tumor DNA detection of minimal residual disease in muscle-invasive bladder cancer treated with curative-intent radical cystectomy: A cohort study”研究中的方法:
收集不同个体的尿液样本(个人尿量有差异,在22-90mL范围内)于含EDTA的无菌瓶中。样本在室温条件(20度左右)下2000g离心10分钟,离心完成后将上清液转移到新管中并保存在-80度。


5
2021年发表在J Clin Microbiol杂志上题为“Diagnosing Pulmonary Tuberculosis by Using Sequence-Specific Purification of Urine Cell-Free DNA”研究中的方法:
尿液样本收集后尽快与EDTA和Tris-HCI(PH 7.5)混合,使两者的最终浓度为25mM和10mM,随后将尿液保存在DNA LoBind tubes中放置在-20度,使用干冰运输到目的地后保存在-80度。后续使用时先将尿液在37度条件下解冻后8000g离心5分钟去除细胞碎片。

从上述5个研究提供的方法可以看出,尿液cfDNA样本的处理和保存方法各异。不过也存在一些共性的地方,比如采集完成后需要尽快对尿液样本进行处理、需要使用EDTA来保护cfDNA,这与一些研究得出的结论相一致,即EDTA可以在室温下保持尿液cfDNA的稳定性。反观在咱们自己的研究中,如果用到尿液cfDNA样本的保存和处理时最好先根据前期的进展总结一套方法并进行预实验,验证方法可行后再进行大规模研究。

参考血液cfDNA的研究现状,小编觉得如果想加速尿液cfDNA的研究,一方面我们需要从基础研究入手,解决尿液cfDNA稳定性的问题。另外,需要专家及商业化机构一起努力,早日形成一套标准的尿液cfDNA样本的保存和分析方法。所谓“道阻且长,行则将至;行而不辍,未来可期”。让我们一起期待尿液cfDNA在不久的将来可以大放异彩。
参考文献
1、Ann Tivey, et al. Circulating tumour DNA — looking beyond the blood. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Sep;19(9):600-612.

2、Qiang Zhou, et al. A novel urine cell-free DNA preservation solution and its application in kidney transplantation. Nephrology (Carlton). 2021 Aug;26(8):684-691.

3、Havell Markus, et al. Analysis of recurrently protected genomic regions in cell-free DNA found in urine. Sci Transl Med. 2021 Feb 17;13(581):eaaz3088.

4、Pier Vitale Nuzzo et al. Detection of renal cell carcinoma using plasma and urine cell-free DNA methylomes. Nat Med. 2020 Jul;26(7):1041-1043.


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