蛋白纯化和表达?

虎威将军

公司给我两个方向，蛋白纯化和表达，有了解这两个流程的嘛？帮我分析一下，顺便问一下蛋白纯化用的试剂是不是有毒呀，谢谢各位

原文地址：https://www.zhihu.com/question/483785605

感恩由您

如今，获得纯蛋白质的能力对于开发靶向药物、研制疫苗和在分子水平上弄清生物过程至关重要。为了满足对这些蛋白质的高需求，蛋白质纯化方法的开发和优化变得越来越重要，确保它们不含可能影响其功能的污染物。
  先进的纯化技术不仅能提升蛋白质的产量与生物活性，还为医学研究和工业应用领域带来了突破性进展。随着这些方法的持续改良，高质量蛋白质的生产效率得以提高，成本效益得到优化，且具备可扩展性，有力地推动了众多科学领域的创新进程与新发现的诞生。
什么是蛋白质纯化？

生物化学与分子生物学领域里，蛋白质纯化指的是中从细胞、组织或其他生物材料的复杂混合物中分离特定蛋白质的过程，而该过程在众多领域领域都是必不可少的，包括:

• 生物研究：开发酶和抗体等试剂，可用作理解细胞过程的分子生物学工具。
  
• 诊断：纯化的蛋白质用于开发疾病的测定和测试。
  
• 环境监测：基于蛋白质的生物传感器用于检测污染物。
  
• 食品和化妆品：由于过敏反应的风险，食品和化妆品中的蛋白质含量必须符合某些安全标准。
  
• 法医学：在刑事调查中利用蛋白质识别物质。
  
• 生物制药开发：纯化的蛋白质对于药物开发和生产至关重要，包括治疗性蛋白质和疫苗。
  

- 蛋白质的来源

蛋白质可以从天然表达的天然组织或细胞中分离。这种方法通常用于难以重组表达的蛋白质或在其天然环境中研究蛋白质时。或者，许多蛋白质是使用基因工程生物生产的 ，这些蛋白表达量高且容易认为控制。
-提取

破坏细胞获取包含全部靶蛋白的内容物，可通过多种方式来实现。例如，机械破碎 (通常用于细菌和酵母细胞)，化学破碎 (使用去污剂，有机溶剂或离液剂) 和酶水解作用 (可以帮助分解细胞壁，特别是在细菌细胞中)。反复冻融和压力循环是有效裂解细胞的替代方法。
-增溶和稳定

通过使用适当的缓冲溶液、蛋白酶抑制剂和保持蛋白质溶解度的其它试剂确保蛋白质在溶液中的可溶性与稳定性。对于膜蛋白，可能需要去污剂以避免它们的聚集和沉淀。
-纯化

纯化指的是从蛋白混合物中分离出靶蛋白的过程。常用的技术包括：（1）离心: 分离细胞碎片。（2）沉淀方法: 通过改变溶解度来浓缩蛋白质。（3）色谱技术 (亲和、离子交换、尺寸排阻和疏水相互作用)：基于不同性质 (分子大小、电荷等) 分离蛋白质。（4）超滤和透析: 浓缩和脱盐样品。
-表征和分析

该步骤用于确认纯化的蛋白质的同一性、纯度和功能性。常用的技术包括:（1） 电泳 (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE))可评估蛋白质纯度和分子量。（2） 光谱方法 (UV-VIS，荧光)，确定蛋白质浓度和结构性质。（3）活性测定，验证分离的蛋白质的功能完整性，如果是酶可以检测其水解某底物的活性。（4）核磁共振 (NMR) 光谱，X射线晶体学和质谱提供详细的结构和功能信息。



典型蛋白质纯化工作流程

蛋白质提取方法

蛋白质提取是纯化过程中的关键步骤，涉及破坏细胞以释放蛋白质。可根据细胞类型和靶蛋白的稳定性使用各种方法 。每种方法都有优缺点讨论如下：
- 机械方法

• 匀质化：采用机械剪切力来破壁。它对坚韧的植物和动物组织非常有效。但该过程可产生热，这可使敏感蛋白质变性。
  
• 超声法：利用超声波破坏细胞膜。这是一种常用于细菌破壁的快速方法，而且对于小体积非常有效。一般需要在低温条件下进行以防止蛋白质由于产生的热量而变性。
  
• 压力循环：使用高压诱导细胞裂解，适用于酵母等坚韧细胞，对蛋白质温和。这种方法的缺点是需要专门的设备进行。
  

-非机械方法

• 去污剂：通过破坏脂质双层来溶解细胞膜完成。常见的去污剂包括Triton X-100和SDS，使用十分广泛。高浓度下使用去污剂可使蛋白质变性，而且还需要在进一步纯化之前除去。
  
• 有机溶剂：溶剂如乙醇或丙酮可用于沉淀蛋白质和破坏膜。这是一种快速的方法，但它并不适合所有的蛋白质类型，因为它会导致蛋白质变性。
  
• 离液剂：破坏蛋白质内的氢键，有效地使蛋白质溶解。常见的包括尿素和盐酸胍。对于不溶性蛋白质十分有效，但也可是蛋白质变性。
  
• 冻融：通过反复的冷冻和解冻循环形成的冰晶裂解细胞，这是一种简单的裂解细胞的方法，因为它不需要特殊的设备，但所需时间较长。
  
• 酶处理：如溶菌酶分解细菌细胞壁，这种方法是非常特异的，并保持蛋白质的完整性。不幸的是，它的使用仅限于细菌，并且需要额外的步骤来完全裂解细胞。
  

蛋白质提取常用方法

蛋白质纯化技术

蛋白质纯化涉及几种技术，每种技术都根据蛋白子分子量大小，电荷或亲和力等特性来分离蛋白质。
- 离心

通过高速旋转样品，离心分离基于其密度的组分。在该过程中，较重的颗粒 (例如细胞碎片) 沉积在底部，从而允许收集含有蛋白质的较轻的上清液。该技术通常是纯化的第一步，用于去除大的污染物并从粗提取物中浓缩蛋白质。
-沉淀

通过改变蛋白质的溶解度以使它们聚集并从溶液中沉淀出来，可通过使用盐 (盐析) 如硫酸铵、有机溶剂或改变pH来实现。尽管该过程可以导致污染物的共沉淀，但它对于初始蛋白质浓缩和分级分离是有用的，特别是样本较多的时候。
-色谱法

亲和层析（Affinity Chromatography）：是一种基于生物分子间特异性相互作用（如抗原 - 抗体、酶 - 底物或激素 - 受体等）的分离技术。它的核心原理是将具有特定亲和力的配体（Ligand）固定在层析介质（通常是琼脂糖凝胶等固体支持物）上，当含有目标分子（也称为靶分子，Target Molecule）的混合样品通过层析柱时，目标分子与配体特异性结合，而其他杂质分子则由于没有这种特异性结合能力而直接流出层析柱。
离子交换色谱（Ion - Exchange Chromatography，IEC）：是基于离子交换树脂上可交换离子与流动相中带相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据溶质离子对交换剂的亲和力差异而实现分离的一种色谱方法。
尺寸排阻色谱法（Size - Exclusion Chromatography，SEC）：尺寸排阻色谱法，也称为凝胶过滤色谱法（Gel - Filtration Chromatography），是基于溶质分子大小不同而进行分离的一种色谱技术。其核心原理是利用具有一定孔径分布的多孔性凝胶作为固定相。
疏水作用色谱 （Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）：是基于蛋白质等生物分子表面的疏水基团与固定相上的疏水配体之间的疏水相互作用而实现分离的一种色谱技术。



典型的色谱法分离纯化蛋白

-超滤和透析

超滤（Ultrafiltration）是一种基于膜分离技术的分离方法。它利用半透膜的筛分作用，在压力驱动下，使小分子溶质和溶剂（如水）能够通过半透膜，而大分子溶质则被截留。半透膜上有许多微小的孔隙，这些孔隙的大小决定了能够通过膜的分子的大小范围。透析（dialysis）也是一种膜分离技术，它是基于溶质分子在半透膜两侧的浓度差而进行扩散的原理。半透膜具有一定大小的孔径，允许小分子溶质（如盐、尿素等）自由通过，而大分子溶质（如蛋白质、核酸等）则不能通过。将装有样品溶液（含大分子和小分子溶质）的透析袋放入大量的透析液（通常是缓冲液）中，由于透析袋内外小分子溶质的浓度不同，小分子溶质会顺着浓度梯度从高浓度一侧（样品溶液侧）向低浓度一侧（透析液侧）扩散，直到两侧小分子溶质的浓度达到平衡。
-电泳

蛋白质电泳（Protein Electrophoresis）是基于蛋白质分子在电场中的迁移率不同来对蛋白质进行分离和分析的技术。蛋白质分子带有电荷，其电荷的来源主要是蛋白质分子中的酸性和碱性氨基酸残基。在不同的 pH 条件下，蛋白质分子的带电情况不同。最常见的SDS - PAGE（十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳）。SDS 是一种阴离子去污剂，它能与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，并且使蛋白质分子的形状近似为棒状。在 SDS - PAGE 中，蛋白质的迁移率几乎只与分子量大小有关。这是一种广泛用于蛋白质分子量测定、蛋白质纯度检测和蛋白质定量分析的方法。
重组蛋白表达

重组蛋白表达是指利用基因工程技术，将编码目标蛋白的基因导入合适的宿主细胞，使宿主细胞在人工控制的条件下大量生产该目标蛋白的过程。通过重组蛋白表达，可以获得大量具有特定功能的蛋白质，用于生物医学研究、药物开发、工业生产等众多领域。重组蛋白表达步骤如下：

• 基因克隆：分离编码目的蛋白质的基因并将其插入质粒或其它载体中。这种重组DNA构建体通常包括调节元件，例如启动子和终止子，以确保正确表达。
  
• 转化/转染：将重组DNA导入宿主细胞。对于细菌和酵母细胞，此过程称为转化，而对于哺乳动物和昆虫细胞，此过程称为转染。
  
• 阳性克隆筛选：使用抗生素抗性标记或在载体上编码的其他选择系统来选择已成功掺入重组DNA的宿主细胞。
  
• 蛋白表达：在诱导重组蛋白表达的条件下培养选择的宿主细胞。该步骤可以涉及优化生长条件，例如合适的温度、pH和充足的营养物质。
  
• 蛋白收获：裂解属主细胞并通过上述蛋白质分离纯化技术得到重组蛋白质。
  

重组蛋白表达流程

表达系统	优势	劣势	应用	举例
哺乳动物细胞	正确折叠和翻译后修饰 (PTMs)，高生物活性	成本高，增长缓慢，培养条件复杂	治疗性蛋白质类，复合糖蛋白类	单克隆抗体
昆虫细胞	高产量，复杂的PTMs，比哺乳动物更容易培养条件	成本适中，PTM可能不同于哺乳动物	疫苗生产，研究蛋白质	杆状病毒表达系统
酵母细胞	生长快，性价比高，培养条件简单	与哺乳动物系统相比，有限的PTMs，高糖基化	工业酶，基础研究，疫苗	乙肝疫苗生产
细菌	快速生长，高产，培养简单，成本低	错误折叠，包涵体，缺乏PTMs，内毒素污染	简单蛋白质，工业酶	胰岛素，重组酶
藻类	可持续、经济高效	技术欠发达，蛋白质产量可变	生物燃料，生物制药，营养补充剂	用于疫苗抗原的藻类叶绿体系统
无细胞	快速、无需细胞培养，直接控制环境	成本高，蛋白质产量有限	研究，合成生物学，高通量筛选	蛋白质快速成型

重组蛋白的纯化

-1.蛋白质标记和亲和纯化

蛋白质标记涉及将特定氨基酸序列添加到目的蛋白质以促进纯化。最常见的标签是His和GST标签，但还有其他标签，如MBP，FLAG和Strep标签。
His-Tag蛋白纯化：His标签由6至10个组氨酸残基的序列组成，所述组氨酸残基与金属离子如镍或钴强烈结合。这种结合被用于固定化金属亲和层析。His-标记的蛋白质与带有镍或钴离子的树脂结合。洗去污染物，用咪唑或通过降低pH来洗脱蛋白质。
GST-tag蛋白纯化：GST-tag是与固定在树脂上的谷胱甘肽结合的谷胱甘肽S-转移酶。GST标记的蛋白质与谷胱甘肽树脂结合，并且在洗去污染物后，用还原型谷胱甘肽洗脱蛋白质。

标签	描述	结合配体	大小	应用
HIS	多组氨酸序列	镍/钴离子	小	亲和层析，蛋白互作
GST	谷胱甘肽S-转移酶	谷胱甘肽	大	溶解度增强，Pull down，蛋白互作
MBP	麦芽糖结合蛋白	直链淀粉	大	溶解性增强，蛋白质折叠，亲和层析
FLAG	短肽 (DYKDDDDK)	抗FLAG抗体	小	亲和层析，蛋白互作
Strep	链霉亲和素结合肽	链霉亲和素	小	亲和层析，蛋白互作

-2.溶解/重折叠

有时，重组蛋白易形成包涵体，特别是在细菌表达系统中。蛋白重折叠和溶解技术可用于回收功能性蛋白质。该方法包括使用使蛋白质变性的离液剂如尿素或盐酸胍溶解包涵体。然后，通常在有助于正确折叠的添加剂存在下，通过逐渐去除离液剂来缓慢重折叠蛋白质。



重组蛋白纯化及增溶、重折叠方案

技术	优势	劣势	适用蛋白质
His-tag	简单、稳定、经济高效	金属离子，可能不会结合所有蛋白质	大部分在大肠杆菌中表达的蛋白质
GST-tag	高亲和力，增强溶解性	大标签可能会影响功能，需要移除标签	需要增强溶解度的蛋白质，真核蛋白质
重折叠/增溶	从包涵体中回收功能蛋白	耗时，需要优化	不溶性蛋白质类，在细菌中表达的蛋白质类

蛋白质分析

-蛋白质浓度测定

Bradford测定：Bradford 法是一种用于蛋白质定量的比色法。它主要基于蛋白质 - 染料结合的原理，考马斯亮蓝 G - 250 染料在酸性溶液中呈棕红色，当它与蛋白质结合后，会变成蓝色，并且在 595nm 波长处的吸光度与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系。这种颜色变化主要是由于蛋白质分子中的碱性氨基酸（如精氨酸）和芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸）与考马斯亮蓝染料的结合导致的。
二辛可宁酸 (BCA) 测定：二辛可宁酸（BCA）测定法是一种基于蛋白质将二价铜离子（Cu²⁺）还原为一价铜离子（Cu⁺）的比色法。在碱性环境下，BCA 试剂中的二辛可宁酸与 Cu⁺形成紫色络合物，该络合物在 562nm 波长处有强烈吸收，并且吸光度与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系。其反应过程涉及蛋白质中的肽键和一些氨基酸残基（如半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸等）对 Cu²⁺的还原作用。
荧光测定：利用一些能够与蛋白质特异性结合的荧光染料来进行蛋白质定量。这些荧光染料在未结合蛋白质时，荧光信号较弱或无荧光，当与蛋白质结合后，荧光信号显著增强。例如，荧光素（FITC）和罗丹明（Rhodamine）等染料可以通过共价键或非共价键与蛋白质结合，然后在合适的激发光下发射出荧光，荧光强度与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系。
紫外-可见分光光度法：蛋白质分子中的一些氨基酸残基（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）在紫外区（200 - 300nm）有吸收。其中，色氨酸在 280nm 附近有最大吸收峰，酪氨酸在 274nm 左右有吸收峰，苯丙氨酸的吸收峰在 257nm 左右。由于大多数蛋白质都含有酪氨酸和色氨酸，因此可以在 280nm 处通过测量吸光度来估算蛋白质的浓度。
-纯度分析

SDS-PAGE：该技术基于大小分离蛋白质。它对评估纯度和分子量非常有效。
蛋白质印迹：经过SDS-PAGE后，将蛋白质转移到膜上并用特异性抗体检测，该技术可以对靶蛋白定性与定量分析。
酶联免疫吸附测定 (ELISA)：酶联免疫吸附测定是一种基于抗原 - 抗体特异性反应的生物检测技术，可分为间接法、夹心法、竞争法。
-活性测定

酶联免疫吸附测定 (ELISA)：酶联免疫吸附测定是一种基于抗原 - 抗体特异性反应的生物检测技术，可分为间接法、夹心法、竞争法。
放射性配体分析：是一种利用放射性标记的配体（如激素、神经递质、药物等）来研究受体 - 配体相互作用的技术。其核心原理是基于放射性标记的配体与靶受体之间的特异性结合。
表面等离子体共振 (SPR)：表面等离子体共振是一种光学检测技术，用于实时监测生物分子间的相互作用。其原理基于金属薄膜（通常是金或银）与入射光之间的相互作用。
-结构分析

核磁共振波谱：主要研究具有核磁矩的原子核（如 ¹H、¹³C、³¹P 等）在强磁场中的能级分裂和共振跃迁现象。当处于外磁场（B₀）中的原子核，其核磁矩会与外磁场相互作用，导致原子核的能级发生分裂。以氢原子核（¹H）为例，它会分裂为两个能级。当用射频脉冲（RF）照射样品，且射频频率（ν）满足共振条件（ν = γB₀/2π，其中 γ 为旋磁比，是原子核的固有属性）时，原子核会在两个能级之间发生跃迁，吸收射频能量，产生核磁共振信号。这些信号经过傅里叶变换等处理后得到 NMR 谱图。不同化学环境中的原子核（如不同位置的氢原子）会受到周围电子云的屏蔽或去屏蔽作用，导致它们的共振频率稍有差异，在谱图上表现为不同的峰，通过分析这些峰的位置（化学位移）、强度、裂分情况等信息，可以推断分子的结构和化学键的信息。
冷冻电镜 (cryo-em)：是一种运用超低温冷冻技术，在透射电子显微镜下观察样品的显微技术。含水样品溶液涂抹在网格上，并在液态乙烷或液态乙烷和丙烷的混合物中快速冷冻，使样品中的水分子迅速冷却形成无定形态的玻璃态冰，从而将生物大分子固定在接近生理状态的结构中。利用透射电子显微镜，电子枪产生的电子在高压电场中被加速到亚光速，在高真空的显微镜内部运动，通过一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进行聚焦成像以及放大，得到样品的二维投影图像。使用计算机对大量不同角度的二维图像进行处理和计算，依据中心截面定理，通过对这些二维投影的分析和整合，重建出生物大分子的三维结构。
圆二色性：是一种用于研究生物大分子（如蛋白质、核酸）二级结构的光谱技术。其原理基于手性分子对左旋和右旋圆偏振光的不同吸收。
荧光光谱：物质的分子或原子在吸收特定波长的光辐射后，电子从基态跃迁到激发态，处于激发态的分子或原子不稳定，会通过各种方式释放能量回到基态，其中一部分能量以光的形式发射出来，产生荧光26
X射线晶体学：X 射线照射晶体时，晶体中的电子会对 X 射线产生散射作用。由于 X 射线的波长与成键原子之间的距离可比，当满足布拉格定律时，散射的 X 射线会相互干涉加强，形成衍射图案124
-稳定性测试

通过使用差示扫描量热法研究稳定性，差示扫描量热法是一种测量与蛋白质展开相关的热变化的技术，可提供有关热稳定性和折叠的数据。
-定量分析

质谱是进行精确定量分析的最常用的技术，包括蛋白质丰度的测量，结构分析，蛋白质结构的鉴定，PTMs的折叠和相互作用以及检测 (如磷酸化和糖基化)。
结束语：蛋白质纯化是生物技术，药物开发和研究中的关键步骤，可以生产用于各种应用的高纯度蛋白质。利用先进的技术和复杂的分析方法，科学家可以分离和彻底表征蛋白质。该过程确保蛋白质满足最终产品的功效和安全性的必要标准。
<hr/>（文章主要内容来源：Technology Networks - Héctor Zamora Carreras, PhD，July 23, 2024[1]）

清风寡欲

CHO细胞已被广泛应用于抗体和重组蛋白等治疗性蛋白生产，同时越来越多的项目在研发阶段也同样使用CHO细胞进行瞬时蛋白表达，这样的好处在于能够减少与CHO规模化生产的蛋白的PQA（产品质量属性）差异。因此快速生产多种抗体或蛋白用于筛选和初步研究就显得尤为重要，本次我们就来探讨如何提高CHO瞬时蛋白表达效率。
<hr/>瞬转是什么？

首先我们来明确什么是瞬转，我们常说的瞬转和稳转都是需要通过转染过程来实现，转染是将核酸（DNA或RNA）导入到细胞内的过程，最终达到增强或抑制目的基因的目的。如下图，根据DNA是否整合到细胞基因组中，可分为稳定转染（稳转）和瞬时转染（瞬转）。稳转通常是利用抗性基因筛选得到，目的基因被整合到细胞基因组中，确保了目的基因能够随着细胞分裂持续存在，对于蛋白表达应用目的来说即能够持续表达目的蛋白，因此称为稳定表达或稳定转染。与稳转不同，瞬转并未将DNA整合进入细胞基因组，导入的核酸物质会随着细胞分裂或环境因素而丢失，不能够持续存在，因此称为瞬时表达或瞬时转染。



稳转和瞬转比较

瞬转和稳转没有好坏之分，不同的应用方向和实验目的决定了选择哪种方式。对于需要大量持续表达的应用场景，例如抗体药和治疗性蛋白的生产，常用稳转方式。对于蛋白种类多，蛋白量需求小，表达周期短的应用场景，例如抗体药研发阶段和基础科研，常用瞬转方式。
转染方式
转染除了根据是否持续表达分为瞬转和稳转，还可以根据转染方式分为：化学介导、物理介导和生物介导，分别包括多种转染方法（如下图）。

转染类型	转染方法
化学介导	阳离子聚合物法 阳离子脂质体法 磷酸钙共沉淀法 DEAE葡聚糖法
物理介导	电穿孔法 显微注射法 基因枪法
生物介导	病毒感染（AAV、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等）

其中，目前在生物医药领域使用最广泛转染方法是阳离子聚合物法，阳离子脂质体法和电穿孔法。阳离子聚合物和阳离子脂质体都是利用了和核酸结合形成带正电的复合物，然后通过细胞内吞进入细胞。电穿孔法也称为电转，利用瞬时产生的强大电场将细胞膜击穿，相当于给细胞打孔，核酸可以通过这些孔洞进入细胞内部。
阳离子聚合物法由于其效率高、易操作和成本低优势，使用较广泛，例如熟知的PEI（聚乙烯亚胺）。

转染方法	原理	特点
阳离子聚合物法	带正电的阳离子聚合物与核酸的磷酸基团形成带正电的复合物后，与带负电的细胞膜接触，通过细胞的内吞作用进入细胞。	操作简单；转染效率高；细胞毒性低；成本低；
阳离子脂质体法	带正电的脂质体靠静电作用和 DNA 结合形成 DNA-脂质体复合物，然后通过细胞的内吞作用进入细胞	操作简单；转染效率高；脂质体本身对细胞有毒性；
电穿孔法	高脉冲的电压破坏细胞膜，在细胞膜表面形成孔道，DNA 通过孔道进入细胞。	适用于质粒和大片段DNA；不同细胞类型优化电转条件；DNA和细胞用量大；细胞伤害大

<hr/>提升CHO瞬转蛋白表达量的方法

早期CHO瞬转表达量通常较低，在2004年至2011年文献中CHO瞬转表达量大多在60~80mg/L，这也是为什么早期使用CHO瞬转并没有得到广泛的应用。随着培养基、转染试剂和转染方式等的不断优化，现在CHO瞬转表达量可以达到几百mg/L，甚至可以达到g/L级别。原则上在瞬转的每个步骤都会影响最终蛋白产量，以下是提高瞬转蛋白表达量的常用方法：
提高转染细胞密度
在PEI或脂质体转染中，CHO瞬转细胞密度通常为0.5~6 X 106 /mL，高密度转染密度通常为4~6 X 106 /mL，更高的细胞密度通常会带来更高蛋白产量，尤其是适用于表达周期较短的项目。例如在礼来公司发表的一项研究中就通过灌流将细胞培养至30~35 X 106 /mL的初始细胞密度，来提高蛋白表达量。不过在高细胞密度转染时需要考虑转染效率问题和培养基营养问题。
补料优化
高细胞活力和延长的培养周期直接促进了高表达水平的实现，补料培养基的选择，添加策略均会直接影响细胞状态和蛋白产量。
PEI和DNA浓度优化
很多研究人员通过调整PEI和DNA的比例来优化转染效果，如下图，用不同比例的PEI和DNA进行转染，在Day 7检测了表达水平。结果显示不同的PEI/DNA比例对CHO细胞和293细胞瞬转蛋白表达量均产生影响。



（来源：Exploring Parametric and Mechanistic Differences between Expi293FTM and ExpiCHO-STM Cells for Transient Antibody Production Optimization, Antibodies, 2023）

降温策略优化
通过降低培养温度，能够减缓细胞增殖，延长细胞生产蛋白的时间，最终蛋白产量增加。有研究表明在CHOK1SV细胞中使用PEI转染，降温至32℃，单抗产量提高了3倍。CHO-DG44细胞中使用PEI转染，降温至31℃，抗体产量增加超过3倍。
除了之外，还包括序列设计优化，转染试剂优化，转染试剂孵育时间，增强剂的选择，流加策略等方面的优化，但由于研发阶段通常为蛋白筛选和初步探究，需要表达的蛋白种类多，表达周期短，对于CHO瞬转除了需要高蛋白表达量，还有普适性和稳定性的要求。倍谙基已为您优化好一套高效转染和表达的CHO单标表达试剂盒 ---RapidTrans CHO Kit，专为CHO瞬时转染和高效表达设计和优化的蛋白表达试剂盒，包含基础和补料培养基，并搭配最佳增强剂和PEI转染试剂。无论是在研发阶段还是规模生产阶段，RapidTrans CHO Kit都能够为您提供满意的产量和可靠的结果。
<hr/>上海倍谙基生物科技有限公司成立于2014年，由华东理工大学谭文松教授团队创立，专注与动物细胞大规模培养。自2014年成立以来，倍谙基成长十分迅速， 已针对不同细胞自主研发了近百款目录型无血清培养基，包括用于抗体蛋白表达的Eden系列CHO细胞无血清培养基，用于细胞治疗的HIPP系列免疫效应细胞无血清培养基，用于疫苗生产的Vero、HEK293、MDCK、PK15、BHK、MDBK、昆虫细胞等无血清培养基。产品能支持细胞的高密度培养和高效扩增，效果优于其他知名培养基产品，更易于纯化和下游加工，有效提高了细胞制品的安全性和产量，同时为客户大幅度降低生产成本。产品质量和技术服务水平赶超进口同类产品，深受国内生物制药领域企业的首肯和好评。

继续前进

近忙了点啥


鸽了一周哦，自由散漫惯了，要不也不会喜欢干销售这一行，当然鸽的这段时间也不是闲着，是研究车去了，从年前研究到3月底，终于买了人生的第一辆爱车，一台小小卡罗拉哈哈哈。趁着买车的热乎劲，可以出一期最近看车的心得，感兴趣的还是老规矩投票哈。最后我们根据读者投票，我们先将离子交换层析啦。
基本原理
离子交换层析是目前最常用的蛋白纯化技术之一。它利用蛋白和离子之间的电荷相互作用来分离混合物中的不同蛋白。在离子交换层析中,通常使用带有负电荷的离子交换树脂作为固定相,而待纯化的蛋白质溶液作为流动相。当蛋白质溶液通过树脂层时,蛋白分子会根据其表面电荷与树脂上的负电荷发生相互作用,从而被吸附在树脂上。

纯化本质关键
离子交换层析的关键在于,不同蛋白质由于其等电点的差异,通过改变流动液的pH值或加入电解质,可以控制蛋白质与树脂的结合力度,实现不同蛋白质的分离。例如,在低pH值条件下,蛋白质表面电荷较大,与树脂结合力强,此时通过增加pH值可以降低结合力,实现第一组蛋白质的洗脱;而第二组蛋白质由于等电点较高,在此pH下结合力仍较强,需进一步增加pH值才能实现第二组蛋白质的洗脱。通过多次循环改变pH值,就可以实现混合蛋白质的逐步分离。
如何判断蛋白质在某一PH溶液中的电荷量
只需比较蛋白质的等电点PI和溶液的PH值，如果等电点PI大于溶液的PH，那么蛋白质带正电，如果PI小于PH，则蛋白质带负电。交换柱分为阴离子柱和阳离子柱，阴离子柱是为了吸附带负电的蛋白质，而阳离子注是为了吸附带正电的蛋白质。
结合到交换柱上的蛋白质如何取下来
采用盐溶液中的离子和交换柱的蛋白质进行交换，使其脱离，带电荷量少的先脱离，并通过不断加大盐溶液的浓度，洗脱其他带电荷量更高的蛋白质。
恢复与再生
离子交换树脂作为工作材料,在长期使用过程中,其交换位点会逐渐饱和,从而影响其交换效率。因此,对饱和树脂进行恢复或再生成为必要的步骤。
通常有两种方法对离子交换树脂进行处理:一是通过热水或弱酸洗涤,清除吸附在树脂表面或孔隙中的离子,实现树脂的恢复;二是通过强酸或强碱处理,破坏吸附键,剥离深层结合的离子,完全再生树脂。相比恢复,再生能更彻底清除离子,使树脂恢复最初的交换能力。
在操作上,恢复较为简单,主要通过循环冲洗实现。再生需要控制酸碱浓度和时间,防止损害树脂结构，科学合理地进行恢复或再生,对保证离子交换层析系统高效运行至关重要
总结
离子交换层析具有操作简单、成本低廉的优点,在小规模蛋白质初步纯化和中间纯化环节中应用广泛。但是,其分离效率和分辨能力相对较低,难以实现高纯度的蛋白质分离。因此,在后续精细纯化环节,通常还需要结合其他纯化技术,如亲和层析、exclusion层析等进行多级纯化,才能得到高纯度的单一蛋白产物。

卡卡

做蛋白纯化做到崩溃了吗？为啥做蛋白纯化总能踩雷？看完这篇干货，你将能过五关斩六将，万事大吉！


1. 第一关 产品选择


敲黑板：此关最基础也最重要，谨防“一步错，步步错”。

亲和层析作为经典、高效的纯化方法，利用目的分子与填料配基之间特异且可逆的相互作用，可以从细胞裂解液或其他生物样品中，一步纯化得到较高纯度目的分子。
选择一款合适的亲和纯化琼脂糖，可以高效、便捷、可靠地从生物样品中分离蛋白、抗体。如何选择才叫“合适”？且听我慢慢道来：

1.1 抗体基础知识篇，“知己知彼百战百胜”

抗体 (Antibody)，又名免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)，是一种由 B 细胞产生的大型 Y 形糖蛋白。抗体以一个或多个 Y 形单体存在，每个 Y 形单体由 4 条多肽链组成：两条相同的重链 (Heavy Chain) 和两条相同的轻链 (Light Chain) (图 1)。

抗体重链 Fc 区域的特异性序列决定了 Ig 的类型，如 α-IgA、δ-IgD、ε-IgE、γ-IgG、μ-IgM。轻链则有两种类型，分别为 λ 型和 κ 型。





图 1. 抗体结构


1.2 抗体——配体要相配！

心心念念纯化人源 IgG3，一通操作后，目的条带位置空空如也。最后发现，当初选择了 Protein A 当亲和配体。人源 IgG3 和 Protein A，不相配！λ 轻链和 Protein L，不相配！蛋白纯化也讲究门当户对。

抗体的亲和纯化配体包括 Protein A、Protein G、Protein L 等。对于多数哺乳动物，Protein G 比 Protein A 对 IgG 有更高的亲和力，如人 IgG3、小鼠 IgG1 和大鼠 IgG2a，但 Protein G 不能和人的 IgM、IgD、IgA 等结合。

与 Protein A、Protein G 相比，Protein L 具有更广谱的 Ig 结合能力，几乎可结合所有含有 kappa 轻链的 Ig (IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD) 及单链可变片段 (scFv) 和 Fab 片段。谨记根据抗体类型，选择合适的亲和纯化配体 (图 2)。




图 2. 人源抗体与 Protein A、Protein G、Protein L 结合能力对照表


2. 第二关 使用方法选择



MCE Protein A、Protein G、Protein L琼脂糖，可从血清、细胞培养上清液或腹水中一步分离抗体；Anti-Flag 亲和凝胶可通过 IP 等方法捕获目的蛋白；链霉亲和素琼脂糖 则可和生物素化样本高效结合。
抗体纯化“大”实验，IP、Pull Down“小”操作，重力柱“大”而离心管“小”焉。杀鸡焉能用宰牛刀，产品详细使用方法奉上 (如下方案仅供参考，详见各产品使用说明)。

2.1 重力过柱法

适合从血清等生物样本中分离、纯化抗体。一次实验获得大量抗体，妙！
1）装填：根据样品量取适量的琼脂糖填料加入亲和层析柱，让储存液靠重力流出；
2）平衡：随后用平衡 Buffer 对柱子进行平衡；
3）上样、洗杂：将样品上到平衡好的柱子上后，继续用平衡 Buffer 进行杂质的清洗和去除。
4）洗脱：最后用洗脱 Buffer 将目的样品洗脱。




图 3. 重力过柱，纯化抗体


2.2 离心法

适合通过 IP 捕获蛋白或研究蛋白-蛋白间相互作用。精细化操作，稳！
将 Anti-Flag 亲和凝胶吸入离心管，使用离心法操作。离心的方式同样经平衡 → 上样 → 洗杂 → 洗脱四个步骤，前三个步骤 Buffer 的置换通过离心弃掉上清来实现，最后洗脱时离心收集上清。




图 4. Anti-Flag Affinity Gel 的使用步骤


3. 第三关 目的蛋白结合、洗脱


Input 明明有目的蛋白，目的蛋白明明已结合，但洗脱液中却没有目的条带。巧设对照，巧留样，蛋白洗脱，我在行。

■ 巧妇难为无米之炊，想让我“无中生有”？No Way！
检测结果无条带，也许是以下原因。





PS：设置 Input 对照，确定目的蛋白已表达；保留上样后的流出液/离心后上清液，确定样本已结合。每步操作“留一手”，全面复盘 (分析实验失败原因) 有帮助。

■ “变性”？“非变性”？下游实验应用来决定
1）变性洗脱法:  此方法洗脱的蛋白样品后续可直接做 SDS-PAGE 检测，简便、高效。
2）非变性洗脱法:  此方法洗脱的蛋白样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。常用的有酸性洗脱法，低 pH 水平可以解离大多数抗体-抗原相互作用。

■ 洗脱后杂带多、纯度低
面对这个棘手的问题，我们首先需要分析杂蛋白的来源：是来自于目的蛋白的降解产物？与填料的吸附？还是与目的蛋白的互作？
1）蛋白部分降解：使用恰当的蛋白酶抑制剂；如对于低 pH 环境很敏感，需在洗脱前的接收管中提前加入中和液。
2）蛋白非特异性结合在抗体、凝胶或离心管壁上，建议对裂解液进行预处理，去除非特异性蛋白；在最后一次洗涤前，将样品转移到新的离心管中操作；洗涤效果不佳，建议增加洗涤时间及次数，增加洗涤 Buffer 中 NaCl 或去垢剂的浓度等。

4. 第 四关 WB


破解 Western Blot 各种实验 bug 的最全秘籍，见往期推文，我就不信这个邪！打破 Western Blot 玄学操作。
<hr/>快快关注我吧，让我带你过五关斩六将，做个科研超人！
公众号：MCE抑制剂
官网：https://www.medchemexpress.cn/
电话：4008203792
售后技术支持：021-58950656
销售邮箱：sales@medchemexpress.cn
售后技术支持邮箱：tech@medchemexpress.cn



公众号

相关产品

亲和层析柱 Affinity Chromatography Column 可以搭配填料，用于纯化具有不同标签的酶、抗体、抗原、重组蛋白等。

谷胱甘肽琼脂糖 Glutathione Agarose 以高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质，可实现高产量，高纯度的 GST 标记蛋白的纯化。

Protein A 琼脂糖 MCE Protein A Agarose 以高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法定向、高效偶联了重组 Protein A，可从动物腹水、血清、细胞分泌液上清等生物体液中一步分离、纯化 IgG 等。

Protein G 琼脂糖 MCE Protein G Agarose 以高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法定向、高效偶联了重组 Protein G，可从动物腹水、血清、细胞分泌液上清等生物体液中一步分离、纯化 IgG 或其片段。

Protein L 琼脂糖 MCE Protein L Agarose 是用于一步分离、纯化含 kappa 轻链抗体的亲和层析介质。

Anti-Flag 亲和凝胶 MCE Anti-Flag Affinity Gel 用于细菌和哺乳动物细胞裂解物以及体外表达系统中 Flag 标签蛋白的免疫沉淀、蛋白纯化实验。

链霉亲和素琼脂糖 MCE Streptavidin Agarose 以高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法共价偶联了重组链霉亲和素，结合能力更强，每毫升介质可结合 30 μg D-Biotin。

巯基偶联琼脂糖 MCE High-Affinity Iodoacetyl Agarose 通过化学方法共价偶联了 Iodine acetic acid 衍生物，能够简单、快速地结合含巯基的蛋白、多肽等生物配体并形成稳定的巯醚键，配体固定后可进行亲和纯化实验。

MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务。

长长的路

蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。
随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。
由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。




蛋白提取纯化程序

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分离、精细分离三个步骤。

01
前处理

分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦，破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。
组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。
02
粗分离

当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用超滤、盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。
03
精细分离
样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析以及分子筛等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。
结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。
蛋白提取纯化方法

01
蛋白质（包括酶）的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（1）水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择：


a.pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

b.盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（2）有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。




02
蛋白质的分离纯化


根据蛋白质溶解度不同的分离方法
（1）蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：
（a）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。
（b）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。
（c）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
（2）等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
（3）低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
（1）透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
（2）凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（Purose  6 Fast Flow  ）。




根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
（1）电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
（2）离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：SP Purose® 6 Fast Flow）和阴离子交换剂（Q Purose® 6 Fast Flow），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

根据配体特异性的分离方法－亲和层析法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。

蛋白提取纯化注意事项

在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，有一些通用的注意事项需要牢记，它们包括：
1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

提取纯化常见问题
1、蛋白纯化标签应该如何选择？
答：在进行蛋白表达时，选择合适的标签有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，因此了解几种常用的蛋白纯化标签很重要。
一般来说，常用的蛋白纯化标签主要有His tag、GST tag、MBP tag、NusA tag、Strep tag，那么这些蛋白纯化标签有什么不同之处呢？
His tag（组氨酸标签）融合蛋白是目前最常见的表达方式，其优点是标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。




GST tag（谷胱甘肽巯基转移酶）的洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，如果蛋白不可溶，很难用变性的方法进行纯化。




MBP tag（麦芽糖结合蛋白标签）可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能会有一定影响。
NusA tag（转录终止/抗终止蛋白标签）不具有独立的纯化标签功能，需要和其他标签（如His标签）联用，可提高蛋白质的溶解性，但由于分子量较大，对蛋白下游应用会有影响。
Strep tag（strep标签）能产出高纯度（95%）的目标蛋白，且能保持目标蛋白活性，主要是因其纯化流程温和。其次，能进行变性条件下的纯化。在用于WB/ELISA，可侦测目标蛋白。另外，还可固定目标蛋白，检测蛋白质交互作用，或更进一步用以筛选治疗用蛋白质，或是工业用酵素。但Strep tag纯化系统的价格相对His tag而言较高，所产出的目标蛋白数相对较少。
2.利用疏水性质，用反向 HPLC 方法分离的原理？
答：反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的 10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.
3.重组蛋白A琼脂糖凝胶 FF 能一次纯化大量血清 IgG 吗？如几十毫升,如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清 IgG，先要偶联其相应配基如抗体或蛋白 A 是吗？这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么？
答：几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的 重组蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 就可以,也可以分两三次纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白 A, 环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,没有非特异吸附,是个不错的方法。
4. 通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？
答：（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。
（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。
5. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?
答：出现这样的情况，主要是缓冲液中 DTT 的影响，DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下镍离子会被 DTT 还原生成棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与（一般的镍柱耐受小于 5mM DTT，推荐缓冲液中不要超 2mM DTT）。
6. 镍柱堵了怎么办？
答：（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心，并过0.22或者0.45的膜
（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 1-2mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行加尿素变性，使其在变形环境下。
（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。
7. 纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？
（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。
（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。
8. 没能纯化到带 His 标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？
（1）超声的功率不对（太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放）
策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。
（2）样品或者是结合缓冲液不正确 ；
策略：检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。
（3）组氨酸的标签没有完全的暴露 ；
策略：在变性条件下（用 8M 脲，6M 盐酸胍，1%SDS） 并加入 1-2mMDTT 进行纯化。
（4）His 标签丢失；
策略 1：WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达，上游构建，改变 his-tag 的位（C-terminal orN-terminal），必要时增加 his 个数（常用 6-10 个）；
策略 2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；
策略 3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。
Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数（组氨酸）6 标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。
蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子。
9. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来，怎么解决？
答：（1）洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
（2）降低 PH 的方法洗脱的，因为若 PH 低于 3.5，会导致镍离子脱落策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。
（3）蛋白已沉淀在柱上策略：减少上样量和孵育的时间，试用去污剂（1%-2%Tritonx-100）或改变 NaCl 的浓度，或在变性条件下洗脱（用 8M 脲，或 6M 盐酸胍），最终也可在洗脱 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。
（4）非特异性疏水或其他相互反应策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。
10. 如何处理样品，可使其初步提纯（如何洗去蛋白的自身带）？
答：（1）上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。
（2）去大肠杆菌自身带（两条 30KD-40KD）可用非变性缓冲液超声悬浮（加入去垢剂），离心 6000r/min，30min，10℃。（若效果不够可继续上述步骤）。
（3）大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可选取其中纯度最佳的。
（4）可用硫酸铵沉淀法，初步提纯。