ELISA（酶联免疫吸附测定）检测细胞样本有哪些处理方法？

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ELISA（酶联免疫吸附测定）检测细胞样本有哪些处理方法？
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清风寡欲

通用酶联免疫吸附试验（ELISA）方案介绍

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于微孔板的试验，用于检测和定量复杂混合物中的特定蛋白质。 夹心酶联免疫吸附试验中靶特异性蛋白的检测和定量通过使用高度特异性抗体完成，将靶蛋白（抗原）固定在微孔板上，间接检测靶蛋白是否存在。这种类型的捕获检测被称为夹心检测，因为被测分析物结合在两种主要抗体之间，每种抗体检测抗原的不同表位——捕获抗体和检测抗体。
请查看以下使用96孔板进行标准夹心ELISA检测实验（比色（显色）和化学发光检测）的方案。
完整流程

• 将靶蛋白特异性捕获抗体附着在微孔板上
  
• 添加与捕获抗体结合的靶蛋白的标准品和样品
  
• 洗去未结合的物质
  
• 添加与固定的靶蛋白结合的检测抗体
  
• 洗掉多余的检测抗体并加入辣根过氧化物酶偶联物
  
• 添加辣根过氧化物酶底物间接检测结合蛋白
  

比色检测

比色夹心酶联免疫吸附试验方案

材料

• 透明96孔板 （例如， MaxiSorp八连管）
  
• 包被缓冲液 （10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4或 50 mM碳酸盐缓冲液，pH 9.4）
  
• 封闭缓冲液（检测缓冲液） （例如， ELISA检测缓冲液）
  
• 洗涤缓冲液 （ 三乙醇胺缓冲或 含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水）
  
• 孔板封膜机 （例如， 96孔板封膜）
  
• 加样槽 （例如 ELISA试剂加样槽）
  
• 捕获（包被）抗体
  
• 检测抗体
  
• 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 (如 辣根过氧化物酶-偶联链霉亲和素）
  
• TMB底物 （例如， TMB稳定显色剂）
  
• 终止液 （1.8 NH2SO4）
  

试验要求的其他材料

• 基于吸光度的微孔板酶标仪（如Multiskan FC酶标仪）
  
• 蒸馏水或去离子水
  
• 样品（见ELISA样品制备方案）
  

化学发光夹心(ELISA)酶联免疫吸附试验方案

材料

• 不透明96孔板 （例如 白色MaxiSorp微孔板）
  
• 包被缓冲液 （10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4或 50 mM碳酸盐缓冲液，pH 9.4）
  
• 封闭缓冲液 （例如， StartingBlock T20 PBS缓冲液或 StartingBlock T20 TBS封闭缓冲液，）
  
• 洗涤缓冲液 （ 三乙醇胺缓冲或 含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水，）
  
• 化学发光底物 （例如 SuperSignal ELISA Pico化学发光底物，货号：37070）
  
• 捕获（包被）抗体
  
• 检测抗体
  
• 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 （检测抗体被生物素化）（例如 辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素，）
  
• 加样槽 （例如 ELISA试剂加样槽）
  
• 孔板封膜机 （例如， 96孔板封膜，）
  

试验要求的其他材料

• 化学发光微孔板读数仪（例如Varioskan ALF 多功能酶标仪）
  
• 蒸馏水或去离子水
  
• 样品（见ELISA样品制备方案）
  

程序

用包被缓冲液中稀释捕获抗体制备包被溶液。关于稀释建议，请咨询赛默飞。

用每孔100 µL的包被溶液包被孔板。盖上孔板，在2–8℃温度下孵育过夜（12–18小时）

吸掉各个孔中液体，并用每孔加入200 µL>的洗涤缓冲液洗涤1次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。

在室温下，每孔加入200 µL封闭缓冲液将孔板封闭1小时。

抽吸、将孔板倒置在吸水纸上，轻轻拍打以去除残余液体。

在封闭缓冲液中制备标准品和样品稀释液。

将100 µL标准品（一式两份）和样品移至指定的孔中。在室温下温和持续摇（~500 rpm）1小时。

吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。

通过在封闭缓冲液中稀释检测抗体来制备检测抗体溶液。对于抗体稀释建议，请参考生产商的说明。

向每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）2小时。

吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。如果检测抗体是辣根过氧化物酶偶联物，则进行步骤15。

如果检测抗体是生物素化的：用封闭缓冲液按1:5000- 1:20000比例稀释制成链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。例如，为满足一个孔板的需要量，在9.998 mL封闭缓冲液中加入2 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶。最佳稀释度应根据经验确定。

如果检测抗体是生物素化的：在每个孔中加入100µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）30分钟。

如果检测抗体是生物素化的：吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。

将等量的鲁米诺和稳定的过氧化物溶液混合，制成化学发光底物溶液的工作溶液。

向每个孔中加入100 µL化学发光底物工作溶液。在室温下孵育1分钟。

添加底物后1至5分钟，使用化学发光仪器测量相对信号值（~425 nm）。添加底物和孔板测量之间的时间间隔较长可能导致信号强度降低。

本文转载自赛默飞，更多指南，请查看赛默飞官方网站。立即访问，查看ELISA试剂限时促销，下单享积分。

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1、细胞培养上清：
1.1、使用96，24，6孔板，(贴壁或悬浮)细胞密度达到60-90%。
1.2、使用6-10mm培养皿，T25/T75细胞培养瓶，(贴壁或悬浮)细胞密度达到60-90%。
1.3、悬浮细胞：2-8℃，2500rpm离心5min，收集澄清的细胞培养上清。
1.4、贴壁细胞：直接收集上清液，2-8℃，2500rpm离心5min，收集澄清的细胞培养上清。
1.5、立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。
2、细胞裂解液：
2.1、悬浮细胞：
2.1.1、2-8℃，2500rpm离心5min，收集细胞。
2.1.2、加入预冷的PBS,轻轻混匀，2-8℃，2500rpm离心5min，收集细胞。
2.1.3、加入0.5-1ml中等强度RIPA细胞裂解液(注意RIPA裂解液PH值需为PH7.3，建议不要使用含NP-40，TritonX-100和高浓度DTT的组分，会抑制抗原抗体反应。若无RIPA裂解液，可使用50mMTris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH7.3)及适量蛋白酶抑制剂(如PMSF，工作浓度1mmol/L),置于冰上，裂解30min-1h。裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解,出现黏糊状是DNA，可以使用超声波破碎DNA。(或用超声波3-5mm探头，功率150-300W,冰上超声处理样品，工作1-2s，停止30秒，3~5个循环)
2.1.4、裂解或超声破碎完成，2-8℃，10000rpm离心10min，上清移入EP管中，立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。
2.2、贴壁细胞：
2.2.1、吸走上清液，加入预冷的PBS洗三次。
2.2.2、加入0.5-1mlRIPA细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂(具体要求同悬浮细胞)，用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞。
2.2.3、细胞悬液转入离心管中，置于冰上，裂解30min-1h，或者配合超声波破碎(同悬浮细胞)。
2.2.4、裂解或超声破碎完成，2-8℃，10000rpm离心10min，上清移入EP管中，立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。
注意事项：
细胞裂解液，建议使用超声波辅助破碎，超声波可有效打断DNA，DNA成为片段后不容易干扰试剂盒工作。
细胞培养上清液/细胞裂解液的选择：
根据目的物所在部位，可选择细胞裂解液或细胞培养上清作为样本。
如果目的物是分泌型，(包括可分泌型的膜蛋白)，即可选择细胞培养上清作为样本；
如果目的物主要存在于胞内，则建议选择细胞裂解液作为样本类型，部分包内蛋白也可能通过分泌或者细胞凋亡而泄露到培养基中而上清也可被检测。

大力水手

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的生物化学检测方法，常用于检测蛋白质、抗体、荷尔蒙等生物分子的存在和浓度。如果需要对细胞样本进行ELISA检测，通常需要进行以下处理方法：

• 细胞裂解：将细胞样本进行裂解，以释放细胞内的蛋白质和其他生物分子。可以使用化学试剂、超声波或冻融等方法进行细胞裂解。
  
• 蛋白质提取：对于蛋白质的ELISA检测，需要使用蛋白质提取液将裂解后的细胞样本中的蛋白质分离出来。
  
• 蛋白质浓缩：由于ELISA需要检测低浓度的分子，因此需要将蛋白质浓缩，以提高检测的灵敏度。可以使用有机溶剂沉淀、膜过滤等方法进行浓缩。
  
• 蛋白质纯化：如果细胞样本中存在其他干扰性蛋白质，需要进行蛋白质纯化以消除干扰。
  
• 稀释：将提取的细胞样本或纯化后的蛋白质进行稀释，以使其浓度适合ELISA检测的要求。
  

以上处理方法可以根据具体的细胞样本和检测目的进行选择和调整。

同花顺

贴壁细胞裂解方法

单层贴壁细胞总蛋白的提取：
      1、倒掉培养液。
      2、每瓶细胞加5ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
     3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
     4、每瓶细胞加400 μ 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
     5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
     6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）
     7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

悬浮细胞裂解方法

    1. 培养1×106-1×107个细胞；
    2. 将细胞转移到15ml圆形离心管，4?C, 500g离心5min；
    3. 小心去除上清，加入5ml预冷PBS重悬细胞，4?C, 500g离心5min；
    4. 尽可能多的去除上清，小心不要碰到细胞沉淀。
    5. 在上步骤获取的细胞中，加入200ul ProcartaPlex Cell Lysis Buffer。
    6. 吹吸混匀8-10次，冰上孵育5min；
    7. 将所有细胞转移到1.5ml离心管；
    8. 4?C, 14000g（离心机最大转速）离心10min；
    9. 将上清转移到新管中。该上清可立即用于检测或者保存在-80?C。
   10. 按照多因子检测试剂盒操作方法检测。样本孔加入25ul细胞裂解液和25ul Universal Assay Buffer。

可选步骤：
    建议细胞裂解后上清进行蛋白定量检测。我们推荐使用Lowry法蛋白定量检测。建议将所有样本使用预冷的ProcartaPlex Cell Lysis Buffer调整样本蛋白浓度方为4-8 mg/ml。

感恩由您

利用ELISA（酶联免疫吸附测定）进行检测的样本类型包括常见的血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清以及不常见的皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水等，这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到ELISA实验的结果。下面对常见细胞样本处理方法整理，希望对您有所帮助。


细胞样本根据目的物所在部位可选择细胞裂解液或细胞培养上清作为样本。 需要注意的是： 因该类样本干扰因素较多， 如细胞状态、 细胞数量、ph、培养基盐离子浓度、采样时间等，所以可能存在检测不到的情况。

• 目的物是分泌型，主要在胞外，即可选择细胞培养上清作为样本，细胞培养上清处理方法相对简单，取细胞培养上清，1000×g 离心 20 分钟，取上清即可检测。
  
• 目的物主要存在于胞内，则建议选择细胞裂解液作为样本类型
  

细胞裂解液：
1）贴壁细胞需要先用胰酶消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集） ；
2）将收集到的细胞用冷PBS 洗3次；
3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融） ：
⇒ 超声破碎：取适量PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂；
⇒ 反复冻融：将待破碎的细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复3次，使细胞溶胀破碎；
4）将标本于2-8 度 1500×g 离心 10 分钟，收集上清备用。
注: 一般情况下，物理方法如反复冻融，匀浆等方法会比化学方法好，因为化学方法会引入酸或碱，可能会对ELISA实验产生影响。利用化学的细胞裂解液裂解细胞，如果去污剂成分会干扰抗原抗体反应影响检测效果，推荐利用透析和超滤的方法除去去污剂成分。
样本保存：
处理样本的过程就是收集目标蛋白的过程，由于蛋白容易变性，降解，故该过程应尽量温和。样本处理之后的储存也非常重要，尤其注意不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存， 4 度保存应小于 1 周，-20 度不应超过 1 个月，-80度不应超过2个月。在标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。
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