全光谱流式细胞术：高维光谱解析驱动的精准医学革命 ——从单细胞动态追踪到肿瘤微环境多组学整合的技术跃迁

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一、全光谱流式细胞术检测原理与多维度解析机制

全光谱流式细胞术基于传统流式技术发展而来，同时具备独特的光学检测与分析能力。传统流式细胞术的光学系统通过分光镜将荧光发射光子引导至特定波段的带通滤光片，经分光后的光信号被对应通道的光电倍增管（PMT）接收。该系统中带通滤光片的波长范围设计可区分不同荧光染料的特征发射峰，从而在有限检测通道中实现单个荧光标记的光谱信息获取。
相比之下，全光谱流式细胞术采用连续波长覆盖的检测器阵列（如高灵敏度PMT或sCMOS相机），能够完整采集荧光染料在整个可见光谱范围内的发射特性。通过数学算法对多通道原始数据进行光谱重建，可精确解析各个荧光标记的完整发射光谱特征，实现基于光谱指纹的多色荧光信号分辨。这种技术突破了传统滤光片分光的限制，为复杂多色流式实验提供了更高维度的光谱解析能力，尤其适用于高参数免疫表型分析与荧光溢漏自动校正等应用场景。


比较传统流式和光谱流式的光学检测配置 (A) 在传统流式上，使用单个检测通道来收集单个荧光染料的发射光信息，仅收集一部分发射光；通过补偿调节荧光溢漏误差。(B) 在光谱流式上，使用多个检测通道来收集所有荧光染料的全部发射光谱信息；通过解析区分不同荧光染料。
全光谱流式细胞术能够同时对单个样本中的数百万个细胞进行精准检测，并在单细胞水平实现高分辨率分析。该技术通过捕获细胞的完整光谱特征，揭示细胞群体的异质性及动态变化，其细胞鉴定与表征能力已被广泛应用于免疫表型分析、生物技术研究、生物制药开发、细胞免疫治疗及临床诊断等领域。
全光谱流式细胞术的核心优势在于通过多通道检测系统捕获荧光染料的完整发射光谱，并结合光谱解析算法区分不同染料的信号特征，从而突破传统滤光片分光的局限性。其关键技术特点包括：

• 光学系统创新：采用棱镜或光栅分光技术，将荧光信号分散至多个检测器（如赛默飞Attune Xenith使用51个检测器），覆盖350-900 nm的光谱范围。
  
• 光谱解析算法：基于已知荧光染料的参考光谱库，通过数学模型解析复杂叠加信号，彻底解决传统补偿方法无法处理的光谱重叠问题，允许使用波峰接近但光谱特征独特的染料组合，显著提升多色实验的灵活性。
  
• 自发荧光校正：将样本背景自发荧光视为独立光谱特征，通过算法精确扣除其干扰，显著提升信号检测的信噪比，确保低丰度荧光信号的可靠识别。
  

二、技术迭代与工业应用里程碑

• 2004年，普渡大学Robinson课题组首次提出光谱流式细胞术的概念，奠定了该领域的技术基础；
  
• 2012年，Sony推出首台商用光谱流式细胞仪，采用棱镜分光和光电倍增管（Photomultiplier Tubes, PMT）技术，实现荧光信号的连续采集与放大。
  
• 2015年后，以赛默飞为代表的多家公司相继推出高性能光谱流式平台。赛默飞的Invitrogen Bigfoot全光谱流式分选系统支持9个激光器和60个检测通道，分析速度高达10万事件/秒，分选速度超过7万事件/秒。了解更多Bigfoot 全光谱流式细胞分选仪可访问链接：https://app-u.jingsocial.com/surl/bOsbw9s，我们会安排专家团队为您提供专业的技术和产品支持。
  

实时光谱解析算法与硬件升级解决了传统流式细胞术在多色实验中因光谱重叠导致的荧光溢漏问题，支持高达几十色的复杂多参数分析，显著提升了单细胞检测的维度与精度。

三、光谱流式与传统流式特征对比

从单个样本中研究更多细胞特性的需求推动了流式细胞术向传统未充分利用的光谱领域扩展。为实现这一目标，仪器硬件与软件算法的进步成功将高速单细胞分析与高灵敏度光子探测技术相结合，拓展了荧光标记应用的维度。此外，紫外、近紫外和近红外光谱区域新型荧光染料的开发持续支持多参数流式细胞术功能。更多激光器和光电探测器的引入支持了更广泛的抗体标记组合，但同时也增加了实验设计与数据分析的复杂性。
光谱流式细胞术的创新有效突破了传统技术中参数数量受限的瓶颈。当前的光谱流式细胞仪在保留传统流式的核心功能（单细胞分析、亚微米颗粒检测、多参数定量检测）的基础上，新增了以下技术优势：

• 荧光标记选择的光谱灵活性；
  
• 自发荧光与背景信号的光谱扣除能力
  

特征比较	传统流式细胞仪	全光谱流式细胞仪
荧光染料的检测波长范围	接近发射波长最大值	~350–900 nm
检测器(荧光染料)数量	一个	多个
修正荧光溢漏方法	补偿调节	光谱解析
选择荧光染料	考虑光学配置	考虑荧光染料的光谱特征是否唯一
扣除自发荧光	否	是

上表为：传统流式和全光谱流式的主要特征比较。

四、全光谱流式技术的双轨化优势体系

1. 高维生物标志物同步捕获策略

针对高参数研究需求，光谱流式技术展现出无可替代的优越性：

• 核心创新技术支撑：光谱流式系统凭借全光谱检测能力，能够完整捕获每个荧光染料的发射光谱特征，形成具有高辨识度的“光谱指纹”。相较于传统流式依赖的补偿校正技术，其采用的算法解析（algorithmic unmixing）方法，即使面对发射峰高度重叠的染料组合或超20种生物标志物同步检测的复杂方案，仍能实现精准信号解析。传统补偿矩阵在高维检测组合（>20个标记物）中易产生累积误差，导致弱信号或重叠信号误判，而光谱解析算法可有效避免此类问题。
  
• 智能化设计革新：得益于专业在线工具的迭代升级，光谱流式用户可借助即插即用式（plug-and-play）虚拟仿真平台进行实验方案在线优化。这类智能工具显著降低了实验设计门槛，使初级用户无需大量实验验证即可深入理解光谱特征兼容性，从而大幅提升科研效率。
  
• 突破性信号处理能力：该技术特有的背景荧光校正功能（需配合未染色样本对照），能够有效消除自发荧光等背景干扰，在复杂样本分析中呈现更清晰的靶标信号。这项技术拓展了传统流式难以企及的应用场景，为肿瘤微环境解析、免疫细胞深度分型等高阶研究提供了关键技术支持。
  

异藻蓝蛋白（APC）与Alexa Fluor 647双染料兼容方案——在配备三激光系统的光谱流式平台上，传统流式中互不兼容的APC（上图）与Alexa Fluor 647（下图）实现了突破性联用。尽管二者发射光谱整体相似，但在紫色（~405nm激发）与蓝色（~488nm激发）激光通道中，其激发态电子跃迁轨迹呈现显著差异（见光谱特征区阴影标示）。这种跨激光通道的多维度光谱指纹解析能力，使得发射峰重叠度>95%的染料组合仍可被精准区分。
2. 低复杂度实验设计的普适性优势

与传统流式技术相比，光谱流式细胞术在常规低参数实验设计中同样表现卓越：

• 简化的信号解析流程：光谱解析技术在低参数设计中依然展现出操作简便的优势。尽管低参数实验涉及的标记物较少（需准备的单色对照也远少于高参数检测），但光谱技术通过自动化软件实现用户友好型解析，避免了传统方法中繁琐的手动补偿流程，显著提升了实验效率。
  
• 优异的光谱分辨能力：对于传统仪器难以处理的弱信号染料或复杂染料（如发射光谱重叠严重的染料），光谱流式系统展现出更强的信号分离能力。其全光谱检测特性能够精准解析这些“问题染料”的独特光谱特征，从而获得更准确的数据。
  
• 面向未来的可拓展性：在光谱平台上开展低参数研究具有长期战略价值。当后续需要针对同一科学问题增加检测参数时，现有实验方案可直接升级为高参数检测体系。这种前瞻性设计为研究深化预留了灵活拓展空间，无需切换技术平台即可实现从基础到高阶研究的无缝衔接。
  

五、前沿应用场景与转化医学实践

1. 免疫细胞异质性解析与功能调控网络研究

全光谱流式细胞术在免疫细胞亚群分型、功能状态分析及动态监测中展现出独特优势。例如，清华大学祁海教授团队利用全光谱流式细胞系统，研究了B细胞亚群的表型与功能异质性，揭示了生发中心反应、记忆B细胞分化及长寿浆细胞维持的分子机制。团队构建了单管32色全光谱流式方案（覆盖分化、代谢、功能及信号通路标记），结合单细胞转录组学与基因编辑模型，实现了对B细胞免疫应答的多维度解析。
研究成果

• 长寿浆细胞（LLPCs）的异质性：骨髓中LLPCs可分为IgG、IgM、IgA亚群，其中IgG LLPCs高表达EpCAM和CXCR3，依赖生发中心亲和力成熟；IgM LLPCs具有固有免疫特征，可能识别自身抗原或肠道菌群；而IgA LLPCs通过外源抗原诱导生成，表达Ly6A且缺乏Tigit。全光谱流式的高灵敏度（APC通道达15 MEFL）和自发荧光校正能力（信噪比25:1）突破了传统技术对稀有细胞检测的局限。
  
• 记忆B细胞再分化调控：代谢异质性（mTORC1活性梯度）驱动细胞命运选择，mTORC1hiGLUT1hi记忆B细胞优先参与二次免疫应答。团队首次鉴定了CD27⁻CD38⁺ pre-plasmablast这一中间态群体，其高表达Blimp-1但缺乏CD138，提示浆细胞分化存在非连续性路径。此外，通过同步检测PD-1与ICOS的共定位，直接验证了T-B细胞突触中的双向信号传递机制，发现ICOS-PD-1交互作用增强BCR信号强度，促进抗体亲和力成熟。
  
• 表观遗传调控与分子机制：提出“表观遗传进行性记录”理论，揭示记忆B细胞的抗原刺激经历通过IRF4依赖的染色质开放程度变化被记录，调控BLIMP1与BACH2的平衡（BLIBA值），决定细胞激活后分化为浆细胞或重返生发中心的概率。利用BARBE报告小鼠（BACH2-tdRFP/BLIMP1-EYFP）动态追踪发现，延迟IRF4印迹积累可促进记忆B细胞二次进入生发中心，为疫苗设计提供新思路。
  
• ZFP318的关键调控作用：发现转录因子ZFP318通过维持线粒体功能（如ROS清除）保障记忆B细胞的再应答能力。ZFP318缺陷导致线粒体膜电位异常，细胞在抗原刺激后易凋亡，其表达水平与疫苗二次应答强度正相关，成为潜在效力标志物。
  

参考文献——
Liu, X., Yao, J., Zhao, Y., Wang, J. & Qi, H. Heterogeneous plasma cells and long-lived subsets in response to immunization, autoantigen and microbiota. Nature immunology 23, 1564-1576, doi:10.1038/s41590-022-01345-5 (2022).
https://www.nature.com/articles/s41590-022-01345-5——文献链接
Shao, W., Wang, Y., Fang, Q., Shi, W. & Qi, H. Epigenetic recording of stimulation history reveals BLIMP1-BACH2 balance in determining memory B cell fate upon recall challenge. Nature immunology 25, 1432-1444, doi:10.1038/s41590-024-01900-2 (2024).
https://www.nature.com/articles/s41590-024-01900-2——文献链接
Wang, Y. et al. High recallability of memory B cells requires ZFP318-dependent transcriptional regulation of mitochondrial function. Immunity 57, doi:10.1016/j.immuni.2024.05.022 (2024).
https://www.cell.com/immunity/abstract/S1074-7613(24)00276-0——文献链接
Liu, X., Zhao, Y. & Qi, H. T-independent antigen induces humoral memory through germinal centers. The Journal of experimental medicine 219, doi:10.1084/jem.20210527 (2022).
https://rupress.org/jem/article/219/3/e20210527/212958/T-independent-antigen-induces-humoral-memory——文献链接

2. 肿瘤微环境多组学整合分析新范式

全光谱技术可同时检测肿瘤细胞、免疫细胞及基质细胞的数十种标志物，为肿瘤异质性研究提供多维视角。例如，荷兰莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center）的研究团队在2023年发表于《Nature Communications》的研究中，利用全光谱流式细胞术，首次绘制了妊娠中期人类胎儿肠道免疫系统的发育图谱。该研究结合全光谱流式、成像质谱流式和单细胞测序技术，揭示了胎儿肠道免疫细胞的时空分布与功能特征。

• 高维免疫分型与动态监测：研究团队设计了3组全光谱流式方案（16-25色），对14-22周孕龄的胎儿肠道样本进行纵向分析。通过25色方案鉴定出7类主要免疫细胞群，包括ILC、B细胞、T细胞和髓系细胞，并发现所有细胞亚群均存在Ki-67+增殖群体，提示胎儿肠道免疫系统在发育早期即具备活跃的自我更新能力。
  
• 体外增殖与功能验证：通过16色增殖分析方案（含CellTrace™ Violet），研究证实胎儿肠道ILC和T细胞在IL-7刺激下增殖能力显著增强，且CD40L和颗粒酶B的表达水平上调。这一发现揭示了胎儿肠道免疫细胞的潜在功能可塑性，为理解先天性免疫耐受机制提供了新视角。
  

该研究充分展现了全光谱流式在多色实验设计中的灵活性——在16色增殖方案基础上，仅需增加9种标志物即可扩展至25色功能分析方案，无需重新优化染料组合或调整激光配置。此外，光谱解析算法有效区分了自发荧光与目标信号，提升了稀有细胞群（如CD8αα+上皮内T细胞）的检测灵敏度。
参考文献——
Guo, N., Li, N., Jia, L. et al. Immune subset-committed proliferating cells populate the human foetal intestine throughout the second trimester of gestation. Nat Commun 14, 1318 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37052-4
https://www.nature.com/articles/s41467-023-37052-4——文献链接

3. 炎症性疾病精准诊断与机制破译

全光谱流式细胞术凭借其高维参数解析能力和多组学整合优势，已成为中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成（NETosis）研究的关键工具。通过多参数组合（CD66b⁺CD15⁺7-AAD⁺MPO⁺NE⁺H3cit⁺），研究人员能够实现NETs的精准识别与动态监测，为败血症、心肌梗死等炎症性疾病的机制研究提供了全新视角。
NETs检测方案创新与多参数组合设计
惠灵顿奥塔哥大学和维多利亚大学的研究团队通过全光谱流式细胞术构建了包含CD66b⁺CD15⁺7-AAD⁺MPO⁺NE⁺H3cit⁺的七色检测方案，全面覆盖NETs形成的核心生物学特征。

• CD66b⁺CD15⁺：特异性标记中性粒细胞，区分静息与活化状态（如PMA刺激后CD16表达下调）。
  
• 7-AAD⁺：结合DNA染料识别胞外DNA释放（NETs核心特征），并通过Zombie NIR区分活细胞（Zombie NIR⁻⁷AAD⁺）与坏死细胞（Zombie NIR⁺⁷AAD⁺）。
  
• MPO⁺NE⁺：检测髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），反映颗粒内容物释放。
  
• H3cit⁺：瓜氨酸化组蛋白H3（H3cit）作为PAD4依赖性NETosis的标志，验证表观遗传调控机制。
  

NETosis动态监测与疾病模型验证
通过体外刺激与临床样本分析，全光谱流式揭示了NETs在炎症性疾病中的核心作用。

• 败血症研究：败血症患者外周血中NET+中性粒细胞比例显著升高，其释放的氧化线粒体DNA（mtDNA）通过激活TLR9/STING通路加剧全身炎症反应。全光谱流式结合DNase处理验证了NETs特异性，DNase I可显著降低NET+细胞比例（p<0.001）。
  
• 心肌梗死（AMI）研究：急性心肌梗死患者NET+中性粒细胞比例较稳定性冠心病（CAD）患者升高3倍（p<0.001），且H3cit表达与心肌损伤标志物（如肌钙蛋白）正相关，提示NETs通过促血栓形成和氧化应激加重心肌缺血。
  

全光谱流式技术通过“表型-功能-机制”三位一体的研究范式，正推动NETosis从基础研究向精准医学的跨越，为炎症性疾病的早期预警与靶向治疗开辟新路径。
参考文献——
Jones C, La Flamme A, Larsen P, Hally K. CPHEN-017: Comprehensive phenotyping of neutrophil extracellular traps (NETs) on peripheral human neutrophils. Cytometry A. 2024 Aug;105(8):639-652. doi: 10.1002/cyto.a.24851. Epub 2024 Jun 12. PMID: 38867433.
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.a.24851——文献链接
Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol 18, 134–147 (2018). https://doi.org/10.1038/nri.2017.105.
https://www.nature.com/articles/nri.2017.105——文献链接

六、赛默飞技术生态：全光谱流式标准化体系的构建

赛默飞作为生命科学领域的全球领导者，在全光谱流式细胞术的技术创新、标准化工具开发及多学科应用拓展方面发挥了关键作用。
1. 全光谱流式硬件系统创新

• Attune® Xenith™全光谱流式细胞仪：采用声波辅助流体动力学聚焦技术，将进样速度提升至传统仪器的5-10倍，同时有效避免样本堵塞问题，尤其适用于高浓度样本（如小鼠组织消化液）的快速检测。在稀有细胞检测及自动化扩展方面具有明显的技术优势。
  
• Invitrogen™ Bigfoot™全光谱流式细胞分选仪：全球第一台全光谱、超高速、高性能的流式细胞分选仪，具有强大的光谱解析和分选能力，同时整合高速电子分选系统与Class II生物安全柜功能，分选速度提升10倍，支持稀有细胞亚群（如CAR-T细胞）的高纯度无损分选，已广泛应用于免疫学研究、细胞治疗研发与临床转化。
  

2. 算法-试剂-标准的协同创新

• NovaFluor™系列抗体与Brilliant Ultra Violet™染料：扩展光谱覆盖范围至紫外至近红外区域，支持32色以上复杂配色方案，并通过“荧光溢漏矩阵”工具优化交叉荧光干扰校正（如BV711与Qdot705的分离）。
  
• AlignFlow™校准微球与AbC™补偿微球：提供标准化荧光参考信号，解决仪器校准与多色补偿难题，确保多色实验中荧光信号的一致性，保障数据可重复性。
  

赛默飞通过硬件创新、算法优化与生态整合，将全光谱流式技术从实验室前沿工具转化为临床与工业级标准化解决方案。其技术生态的持续迭代，不仅突破了传统流式细胞术的物理与算法瓶颈，更推动了从单细胞分析到多组学整合的范式转变。未来，随着智能化、微型化与自动化技术的深度融合，赛默飞的全光谱流式平台将在生命科学研究、药物研发、细胞治疗、精准医疗及再生医学领域发挥核心作用，为复杂生物系统解析与临床转化奠定下一代生命科学基础设施。

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