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[分享] 细胞消化培养操作注意事项与方法分享

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发表于 2022-5-17 12:16 | 显示全部楼层 |阅读模式

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传代培养(消化法)
. 传代前准备
1、预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2、用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手,严格进行无菌操作前
的准备工作。
3、正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
4、点燃酒精灯:注意火焰适宜。
5、取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
6、从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。
7、打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。
注意事项:严格的无菌操作过程
. 胰蛋白酶消化
1、加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。
2、显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。
3、吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。
胰蛋白酶是细胞培养中不可或缺的一种消化酶,传统的胰蛋白酶主要来源于猪或牛的胰脏,经分离纯化得到。在动物胰脏中,胰糜蛋白酶与胰蛋白酶的性质极其相似,提取纯化过程中二者较难分开,通常胰蛋白酶同时隐藏糜蛋白酶活性。针对来源于猪胰脏胰蛋白酶的缺点,上海雅心生物利用基因工程生产出重组胰蛋白酶,重组胰蛋白酶具有与动物源性胰蛋白酶相同的酶学性质,可替代胰蛋白酶使用,且有很多优势,无杂酶活性,无外源性或内源性病毒污染,无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂。
注意事项:
适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:
EDTA 0.20g,NaCl 8.00g, KCl 0.20g, KH2PO4 0.02g, 葡萄糖 2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。
. 吹打分散细胞
1、吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2、吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3、平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。
4、弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
. 分装稀释细胞
1、分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。
2、显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。
. 继续培养
用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++
细胞复苏
.准备工作
1、将水浴锅预热至37℃
2、用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
.取出冻存管
1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2、从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。
.迅速解冻
1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。
2、约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。
.制备细胞重悬液
1、离心(3000rpm,3min)后吸弃上清液。
2、向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。
.细胞计数
细胞浓度以5×105/ml为宜。
.细胞培养
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。

细胞计数
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
.准备工作
取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。
.细胞悬液制备
细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。
.细胞计数
1、盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2、制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3、将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
4、统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。
5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:
(细胞悬液的细胞数)/ml= ( 四个大格子细胞数/4) ×2×104
说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3
.细胞计数要点
1、进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;
2、要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
3、取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
4、数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
5、操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。

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