液体活检系列—一文全面了解循环肿瘤细胞CTC 的检测

长长的路

图 ：CTC 分析方法一览

利用免疫亲和或物理特性法可富集到CTC，接下来还需要结合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC 捕获技术不能保证百分之百的纯度，需要对所得到的细胞进行鉴定，以进一步确定CTC 细胞的数目，以减少CTC 数目判定的假阳性率和假阴性率。另一方面，在肿瘤的发生发展过程中，不仅CTC 的数目在动态的变化，CTC 所携带的分子标志物也在变化，通过对CTC 表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。常用的CTC 检测技术如免疫荧光、PCR、FISH 及高通量测序等。

表 ：CTC 检测技术比较

1、

免疫荧光法（IF） 实体肿瘤细胞一般均为上皮来源，细胞内会表达角蛋(cytokeratin, CK)或其他肿瘤标示物(如HER2)。借助免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC 中的瘤标进行识别，从而达到检测CTC 的目的。这也是目前检测CTC 的最常见方法。缺点是，在CTC 形成过程的间质化(EMT)阶段，大量的CK 会降解，从而在CTC 检测过程中出现因―看不见‖而造成的假阴性。

2、

荧光原位杂交（FISH） 荧光原位杂交，是根据已知细胞内特异的DNA 序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与细胞内的基因组中DNA 分子杂交，检测该特异基因序列的存在与丰度。FISH 技术与CTC结合，不仅可以检测CTC 表面标志物，也可以检测CTC 细胞内部的标志物及核型等。

3、

RT-PCR 反转录PCR。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用引物和逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。再以cDNA 为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。结合RT-PCR 可同时对若干个基因的表达进行检测。位点特异性PCR 技术可用于检测CTC 携带的驱动基因的突变情况。

4、

二代测序 CTC 数量少，直接进行二代测序难度大。需要将单细胞的DNA 扩增后，再利用二代测序检查基因序列。比较有代表性的是多重退火和成环循环扩增技术和多重臵换扩增（MDA）。但是，目前单细胞测序的技术仅仅停留在实验室阶段，未来向市场推广还有很长的路要走。而且由于肿瘤细胞的异质性，单细胞测序是否有代表性还需要更多的科学研究来证明。

CTC 检测技术与检测平台简介

图 ：Cell Search 发展历程

图 ：Cell Search 系统简介

Cell Search 是第一代的CTC 技术。结合了免疫磁珠、流式分析和免疫发光技术而建立的快速、灵敏的CTC 富集和定量检测技术。它利用免疫纳米磁颗粒富集上皮来源的细胞，结合荧光染料的抗CD45 和抗细胞角蛋白（CK）与细胞核DAPI 荧光染色试剂共同识别CTC。Cell Search 检测平台是目前最早的通过FDA 认证的可用于多种癌症预后判断的CTC 检测技术，但目前依然有很多缺点：

1) 检测的灵敏度不够高。部分癌症转移期患者，由与其血液中CTC 含量过低，或者其CTC 本身发生发化而不能被Cell Search 系统所捕获，因此该检测存在假阴性率较高的问题。

2) 得到的是死细胞，无法对CTC 进行分子生物学分析。Cell Search 系统只能捕获并记录CTC 的数量，不能对CTC进行包括基因测序、蛋白表达、药物敏感性检测等更细致的分析。

Cell Search 系统2013 年进入中国销售，到2015 年底3 年内销量上百台，该系统销售单价约400 万。而系统引进后医院的实际检测却不如人意，北京六七家医院平均检测量仅为一两百单。根据公开报道，Cell Search 系统不仅抗体捕获方式局限性大，而且无法实现活细胞捕获并进行后续基因检测以及用药指导。这些技术上的缺陷，注定会被市场边缘化。另一方面，Cell Search 在的检测费用为3000-5000 元每次，而且是多次的动态检测，普通患者无法接受这么高昂的价格。据报道，目前Cell Search 系统已经停产。

针对以上缺点，新一代的液体活检技术在不断的发展。目前，很多公司在开发第二代基于微流控芯片的CTC 分析方法，二代微流控不仅能够检测CTC 的数量，而且可以分离活细胞进行其他分析，是未来CTC 检测的发展方向。微流控芯片内CTC 的分选富集方法主要分为生物化学方法和物理方法两大类。生物化学方法指的是选择特异性抗体对细胞表面表达的标志物进行特异性的抗原抗体吸附,从而分选富集目的细胞。根据分选富集目的细胞的不同可分为阳性选择方法及阴性选择方法。物理方法指的是利用外力场(例如磁场、电场、流体场、超声波等)基于细胞间的物理特性差异(大小、变形性、密度、介电性等)进行分离。在这里，我们着重介绍市场上主流的基于生化方法的微流体技术。

图 ：第一代的CTC 微流控技术（2007 年）

图 ：第二代的CTC 微流控技术（2010 年）

图 ：铺被aptamer 的CTC 微流控技术（2013 年）

图 ：植入静脉的CTC 微流控技术（2012 年）

第一代的CTC 芯片是一种基于微流体学的CTC 检测技术。它在一张与标准载玻片尺寸相同的硅片上面覆盖大量微柱，每一个微柱都包被上能够捕获CTC 的抗体。当血液样品通过微流芯片时，这些微柱确保CTC 在流过芯片前捕获它们。这种设计不仅制造困难，而且成本昂贵，且微柱周围的血流通畅性限制了与抗体覆盖微柱接触的CTC 数量。

第二代芯片在增加血液样本处理量的同时，提高了捕获罕见循环肿瘤细胞的能力。第二代芯片将微芯片安装在标准载玻片上，利用标准的病理检测方法对癌细胞进行鉴别，而且捕获的循环肿瘤细胞还可用于其他检测或用于培育。

第二代芯片在第一代芯片的基础上癌细胞的捕获率提高了25%，可捕捉血液样本中超过90%的癌细胞。第一代的CTC芯片是一种用于捕获罕见循环肿瘤细胞（CTCs）的设备。与第一代CTC 芯片相比，第二代的HB 芯片制作更为简单，且可更高效地捕获肿瘤细胞，提供全面且易于获取的数据。后人在第二代的的基础上加上了aptamer（结合CTC 表面的EpCAM），进一步提高的CTC 的捕获效率。

另一种是体内富集法。将结合EpCAM 的装臵从前臂静脉插入病人体内，并停留30min，从而进行体内CTC 富集。

表 ：CTC 检测仪器比较

（备注：aptamer 是一种单链DNA 或RNA 分子，与目的蛋白有很高的亲和力和特异性；敏感性：是指在合理条件下使用时，给予仪器的参数能够被有意义测得的最小单位。灵敏度越高，仪器能够在越低的CTC 浓度下检测到CTC。特异性：检测到的细胞是CTC的概率。细胞活性：指CTC 在被仪器处理后的生物活性。保留足够的生物活性对于后续的检测非常重要。细胞恢复能力：CTC 在被仪器处理后能够存活并培养的概率，对于后续的细胞培养和耐药性检测很重。富集因子：指仪器对CTC 的富集能力，值越高，富集能力越强）

从上面的对比表格我们可以看到，近年来，已经有大量基于芯片设计的CTC 分离富集仪器，而且已经有大量CTC检测仪器在灵敏性，特异性和富集后的细胞活性上超过了Cell Search 平台。相比于第一代检测仪器，芯片富集具有成本低，细胞活性高，便于后期分析的特点。由于医疗器械进入临床应用实行“双通道制”，所以FDA 批准并不是判断CTC 检测仪好坏的唯一标准。通过FDA 认证有助于产品在市场上的推广和销售；没有通过FDA 的批准，但是产品在获得CLIA 认证的实验室依然可以被用于临床。对于CTC 检测仪器，我们建议主要还是要关注仪器对于CTC 检测的灵敏度，准确性和富集后肿瘤细胞的活性。从对比来看，微流控芯片技术将是未来CTC 检测的主流技术。

CTC 应用场景

图 ：CTC 在癌症治疗中的应用场景

目前CTC 的应用主要在以下几个方面：

1) 在辅助诊断方面，辅助诊断主要是在常规手段无法对早期肿瘤进行判断时进行。例如：肺部小结节患者的活检诊断仅有4%诊断为肺癌，利用CTC 检测可以减少筛查人群，提高检出率，在临床中我们发现早期肺癌患者症状多不明显，组织活检也未必能检测到，此时如果CTC 检测为阳性，有助于癌症诊断。

2) 在疗效评估方面，癌症患者进行化疗、靶向治疗后进行CTC 检测，若CTC 数量减少，提示治疗方式可能有效，相比于现阶段的CT、MRI 等检查手段，CTC 检测技术操作更方便，应用更简单，可以更及时地提示医生该患者是否适合化疗或靶向治疗。

3) 在术后监测方面。以肺癌为例，肺癌患者手术后约50%可能会复发，术后监测非常关键，之前主要监测手段为患者每隔3 或6 个月进行CTC 等检查，主要是由于活检无法高频次检测。而目前CTC 检测在术后监测中应用可能更方便，检测频次会更高。及时检测血液内CTC 的变化，在癌症发生的早期就及时进行治疗，能提高患者存活率。

来源：基因谷