单抗制备动物免疫

笑看风云

关于动物免疫，在多抗制备一部分里已经作了一些讲解（点击这里查看），这里只简要讲述一下单抗制备中需要注意的几个问题。在概述部份已经讨论过，用来制备单抗的动物主要有小鼠、大鼠和兔，由于小鼠易饲养、小鼠单抗技术成熟、路线简单，因此是制备单抗使用的主流动物，这里主要以小鼠单抗制备展开讲述。
免疫途径和周期：单抗制备中，免疫动物的方式一般第一针采用皮下免疫，后面的加强免疫采用腹腔免疫、腘内免疫、皮下免疫或者脾内直接免疫。首次免疫和加强免疫结束后，在融合前三天一般还要进行一次冲击免疫，以增加脾脏内浆细胞的数量。下面这张表列出了常见的免疫途径和周期：
免疫途径和周期


说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
关于操作的问题，这里只作一下简单的介绍，具体如何进行，需要在有相关经验的实验员指导下进行，也可以在网上找到相关视频进行学习。（1）皮下注射。皮下注射的操作有点像给人接种疫苗，即挑取动物的皮肤，将混好佐剂的抗原直接注射。一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。（有的资料上称这种方法为皮内免疫，造成这种概念上的混淆可能是由于早期工作者们的翻译过程出了问题），皮下操作一般由两人进行，一个协助固定小鼠，另一个进行免疫操作。（2）腹腔注射。腹腔注射比较简单，只需要一人操作，操作者由左手抓住小鼠尾巴和颈部皮肤，将小鼠翻转过来，腹部向上，将抗原直接注射到腹腔。如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。（3）尾静脉注射。个人觉得尾静脉注射是技术要求最高的一种注射方式，操作者需要固定小鼠，然后将抗原注射到小鼠尾部静脉（正中间那根血管）。小鼠尾静脉比较细小，一般新手很难操作成功，需要在其它小鼠身上多次尝试才可以进行免疫操作（站长自己尝试了十多次都未成功）。静脉注射抗原对抗原的要求更高，抗原必须不含去垢剂和其它有毒成份，否则极容易引起动物死亡，而且免疫剂量也不宜过大。（4）脾内注射。脾内注射是效果最好的免疫方式，因为这种方式使得脾细胞直接与抗原接触，所以很容易引起免疫应答反应。但是很多人都认为这种方式操作复杂，而且死亡率高，但是参考了一些文献，加上自已实践操作，站长自己总结出了一套比较好的办法，成功率基本上在百分之百。具体操作方法：先用乙醚或戊巴比妥钠进行麻醉，乙醚麻醉过程比较简单，技术含量低，对于初学者比较适用，推荐。事先准备一块棉花，将少量乙醚倒在棉花上，用一烧杯倒扣住，将小鼠也扣在烧杯下，一般在一分钟内小鼠就可以晕到，此时将小鼠取出，用胶带固定在木板或实验台上（腹部向下，背面向上。无需无菌），用手术剪刀剪开背部左侧皮肤（大至就是脾脏所在的位置，不要剪开内膜），剪开小口后，用手将剪口撕大看到腹膜内脾脏即可将用注射器刺穿腹膜，插入脾脏，直接注射抗原，抽出注射器。然后用胶水（推荐AB胶，五金店有卖的）将剪口周围的毛粘好，胶干后在伤口周围涂上抗生素即可，无需要无菌操作。由于需要用到胶水，所以手术前不要用酒精消毒。（5）小腿肌肉注射。这是康碧泉公司的Quickantibody佐剂独有的免疫方法，具体操作是：先抓紧小鼠，用无名指固定一只后腿，将小腿部分用酒精消毒，将混好佐剂的抗原（根据佐剂说明书抗原与佐剂等体积混合）直接注入到小腿肌肉，稍稍停顿后拔出注射器即可。
完成首次免疫和加强免疫后，可以取出少量血清进行效价检测（参见多抗制备中的血清采集与检测 ），达到足够高的效价后即可进行冲击免疫，冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
在单抗制备过程中，除了通过免疫动物得到可分泌抗体的B细胞外，还可以将未免疫的小鼠脾脏取出，在体外进行免疫，从而大大加快制备周期，其基本方法是：取出未免疫小鼠的脾脏，处理成为单个细胞，然后在完全培养基中培养，同时加入一定浓度的抗原刺激其产生抗体。需要注意的是，这种方法由于不存在完整的免疫应答路径，所以只能产生出亲和力不成熟的IgM型的抗体，大部分实验中基本不能使用这种抗体（除非是专门研究IgM抗体特性）。