多抗制备中的血清采集与检测

笑看风云

按照设计的流程免疫完动物后，就可以取少量的血液进行效价检测（采血步骤稍后再述），看看动物是否免疫成功了。效价检测的方法主要有两种， 一种是琼脂扩散实验，另一种是间接ELISA（酶联免疫吸附测定），琼脂扩散实验比较过时，这里简单介绍一下它的原理和方法。
     在低浓度的琼脂糖凝胶里，大分子是可以自由扩散的，当抗原和抗体在琼脂糖凝胶里扩散相遇时会形成抗原-抗体沉淀复合物，这种沉淀复合物肉眼可见，沉淀的量与抗原和抗体的量正相关，控制抗原的量后，沉淀的量仅与抗体的量正相关。操作流程：（1）用PBS将琼脂粉稀释至1%，水浴加热融化，稍稍冷却，将其倒入模具（没有模具弄个瓶盖也行），冷却成型。（2）用打孔器打孔。在中间孔内加入抗原，周围孔内加入倍比稀释的行测血清（倍比稀释可从1：2稀释六个梯度）。（3）放入湿盒中室温放置1-2天，观察产生的沉淀线。
用ELISA检测效价在1：10000以上（cufoff值为1.0），或者琼脂扩散在1:16以上时可以进行血清采集工作了。 下面就说说血清的采集方式。
话说采血，一言以敝之就是找个合适的血管弄破让血流出来。需要的血量与血管的直径成正比。在采血的时候只需要考虑两个问题：怎么样获得足够多的血以及怎么样减少动物的痛苦。网上经常可以看到各种各样的采血方式，但实际常用的方法却比较有限。本人不喜欢那种把动物搞得死去活来的方法，除非是迫不得已。这里介绍几种常见的采血方法。
小鼠的采血。如果是需要进行效价测试，一般只需要几微升血就够了，这种情况下大多都采用尾部采血。很多人从学校实验室师兄师姐那里学到用剪尾的方法取血，本人觉得此法极不人道，剪尾的方法比较方便，速度也很快，只是给老鼠带来的痛苦比较大，而且很多老鼠经过剪尾后尾巴会逐渐坏死。一个比较好的方法是先用酒精将尾巴消毒，再用小号注射器扎破尾静脉（正中间那根），然后捏紧尾巴由近心端向远心端挤出血滴即可，为了方便日后再采，首次采血时尽量从靠近尾巴末端下针。新手操作可能觉得此方法比较困难，但是熟练之后往往可以一针见血。如果觉得效价不错，需要大量的血的时候，就可以杀死老鼠放出全部的血了。最常用的办法就是摘取眼球取血，其方法是用左手无名指和小指夹住老鼠尾巴，用大拇指和食指紧紧抓住老鼠的颈部皮肤使眼球突出，用摄子迅速摘掉眼球，将血滴入EP管内即可，采血完后断颈处死小鼠。用这种方法通常可采血1-2ml左右。 由于小鼠体型小，不宜进行多次大量采血，确实需要大量抗血清但又不想杀死小鼠时，可以将小鼠麻醉，然后剪掉胸部的毛，用针刺穿心脏采血，为了保证小鼠不死亡，这种采血不能超过0.4ml。最好的办法是免疫多只小鼠或者直接免疫体型较大的动物。
这里有两个概念需要注意一下，血液和血清的区别。血液就是你直接从动物身上得到的东西，也就是全血。将血液静置后会凝固，去掉固形物后的液体即为血清。为了去掉血细胞的干扰，采血后都需要将全血处理为血清。具体的方法：采血后将血清在室温静置30min，然后放4℃静置30min，再用离心机10000g离心30min。取出上清去掉沉淀即可。如果长时间不用，可以加防腐剂放在-20℃保存。由于此时的血清中含有我们所需要的抗体，所以又叫抗血清。下面接着说采血。
兔的采血。兔子看起来很温顺，但是一旦受惊吓时会变得凶猛甚至咬人，因此操作时尽量轻柔，需要两人合作或购买专用的架子。少量和中量采血建议在耳缘静脉采集，方法是先将耳部进行简单消毒，用手指轻弹耳朵使其突出，将针头逆血流方向平行插入即可抽血，这种方法一般可采血10ml左右。如果只需要做ELISA检测，插入针头后直接拔出所流的血量已足够。采完血后用棉球压迫止血。需要大量取血时可以采用心脏采血或者颈动、静脉采血。心脏采血的操作和小鼠心脏采血类似，颈动脉或静脉采血则是将兔子麻醉，然后剪开颈部皮肤，分离出动脉或静脉进行采血。采血完后需要马上缝合伤口。心脏采血一般可以采20ml左右，颈部动脉采血可以采10ml以上。采完血后按前述方法进行预处理再存放。