关于儿童疾病检测的经验探讨——访河北省儿童医院检验科主任李贵霞

检验之星

《医学仪器与试剂》（以下简称《医》）：关于儿童呼吸道感染检测，降钙素原、肺炎衣原体抗体IgM和肺炎支原体抗体IgM的临床意义？在您的工作中，有没有特殊病例，实验室与临床诊断是如何对接的？
李贵霞：
        儿童呼吸道感染是临床常见病症，可由多种病原体引起，90％以上是非细菌性的，其中大部分由病毒引起。最近几年肺炎支原体（MP）和肺炎衣原体（CP）感染有明显上升趋势，一般呈散发或小流行，但每隔2～6年会出现大流行，具有地方性和周期流行性的特点，一年四季均可发病。不同感染治疗用药有很大区别，仅靠临床症状和影像学检查难以区分感染病源，尤其混合感染的判断和鉴别诊断等，实验室检测对明确感染有重要意义，可以指导临床选择针对性的治疗措施、减少抗生素的滥用，并有助于病情变化的观察和预后的判断。
       降钙素原是降钙素的前体，健康人血液中的PCT值非常低，感染疾病监测PCT存在天然优势，当细菌感染时，PCT生成并释放入血液循环升高明显，故其生成和释放具有高度特异性，病毒、寄生虫等其他感染时PCT水平正常或仅轻微上升，另外PCT反应快速，在内毒素等细胞因子诱导下, 2-3h 开始增加, 12-48h到达峰值，有利于早期诊断，PCT半衰期短，大约20-24小时，连续动态监测有助于判断脓毒症严重程度、监测临床病情变化、评估危重风险程度、帮助分层治疗的决策、快速反映抗生素治疗效果、可显著减少抗生素使用时间，也是判断治疗成功及失败的重要预后信息，脓毒症初始PCT水平大于1ng/ml，快速下降到PCT 水平小于1ng/ml，代表预后良好，下降缓慢甚至不下降或反而升高，表示预后差。早产儿、新生儿患者在临床表现往往无特异性，用临床手段常常难以区分不同的感染源，血液、肿瘤病患儿给予免疫抑制疗法合并儿童呼吸道感染或伴有继发性免疫病理改变如风湿性发热等，也很难将原发病与原发性细菌感染相区别，PCT可以较传统方法更早更具特异性帮助临床做出诊断。但应注意早产儿和新生儿PCT年龄依赖性正常值，PCT于出生后24-30小时达其生理性高峰，出生后第三天起同成人参考水平，另外PCT反映了全身炎症反应的活跃程度，细菌内毒素在诱导PCT升高过程中担任了至关重要的作用，影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况，不产生内毒素的细菌感染、局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症可能不会导至其PCT升高。

        B·R·A·H·M·S基于大量实验数据缜密计算并结合临床经验建立了自己的Cut-off值，仅适用于使用B·R·A·H·M·S产品测得的标本值，个人认为其他公司的PCT产品公司直接使用由B·R·A·H·M·S建立的0.5ug/l和2ug/l判断限值是否合适值得考虑和验证。ISO17511指出在相同的计量水平下，测量相同量的两个测量程序的测量结果具相关性，但这样的水平相关性不提供计量可追溯性，相关系数尽管接近1，比对间还存在着“显著差异”，不能说明结果一致，与B·R·A·H·M·S PCT比对的相关性并不代表具有溯源性。不同品牌产品应该通过大量临床试验，建立自身的限值或对使用0.5ug/l 和2ug/l 判断限值有具体说明。

        肺炎支原体抗体IgM（MP IgM）是肺炎支原体感染后最早出现的特异性抗体，发病后不久即可出现升高，7天即可检出, 10-30天后抗体浓度达到高峰，12-16周抗体效价逐渐降低，直至不能检测，持续时间在不同个体中差异较大，儿童的IgM反应一般强于成人，约50%的成人患者在Mp感染后无法测到IgM的升高。在儿童社区获得性肺炎管理指南（2013）和儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015）对肺炎支原体抗体检测均指出急性期和恢复期双份特异性IgG抗体比较有4倍以上的升高或下降到原来的1/4是MP感染的确诊依据，但双份血清检查可行性差，尤其儿童，而且没有早期诊断价值，因而单份血清特异性IgM抗体的明显升高是目前临床诊断MP的主要实验室依据，一般认为MP-IgM≥1?160有较高的诊断价值。目前MP抗体的血清学检测方法有颗粒凝集试验、酶联免疫吸附试验和快速酶免分析法等，近年临床较多采用明胶颗粒凝集试验，快速酶免分析法操作简便、快速，对急诊筛查有一定作用，但因是定性测定，无法观察病情和转归情况，目前MP IgM检测国内外快速检测没有统一的实验室诊断标准，不同试剂选择的肺炎支原体抗原不同，诊断标准（CUTOFF值）也各自不同，导至特异性和灵敏度存在差异，各试剂间缺乏可比性，最好用同种试剂进行临床连续观察。

        人类对Mp无先天免疫性，也尚无可实际应用的有效疫苗；感染后也不能产生完全的保护性免疫，例如某患儿2015年1.24日-2.17日肺炎支原体抗体滴度监测情况分别24日为1?640，治疗后2月1日为1?160，滴度下降说明治疗有效，2月3日<1:40，但在2月9日又被再次感染，检测滴度为1?1280，治疗后2月17日又降低为1?320。抗体的滴度与MP感染患儿的病情严重程度呈正相关，治疗有效抗体滴度逐渐下降，从上述患儿的抗体滴度表现也可以看出MP IgM抗体滴度对观察治疗效果、判断病情程度有一定的指导意义。

        但应注意 MP感染早期、6个月以下的婴儿、重复感染、抗菌药物早期应用以及体液免疫缺陷或受抑制可影响检测阳性率，可以检测不到。MP IgM抗体用于临床诊断应考虑采样时间，是否在临床症状出现一周内和患者年龄，如在一周内IgM抗体可能尚未产生，如患者为成人可能曾经感染过MP，再次感染时常常不产生IgM抗体，所以检测阴性也不能排除MP急性感染。明胶颗粒凝集试验是检测IgM和IgG的混合抗体，在临床应用中要结合病程和其他检查综合判断。

肺炎衣原体我们实验室没有测定，不做阐述。

《医》：C-反应蛋白及降钙素原联合检测对儿童发热性疾病的诊断意义？
李贵霞：
        C-反应蛋白及降钙素原都在感染急性期出现，都可作为感染性疾病临床观测指标，基于二者的生物学特性不同、出现时间早晚不同、达到高峰时间不同、半衰期不同和在体内时间不同，敏感性和特异性各有千秋，刚才谈了PCT测定中的某些局限性如年龄，C-反应蛋白可不受患儿性别、年龄、贫血和高球蛋白血症等因素影响，即使患儿机体反应低，白细胞正常，CRP也可升高，联合检测对儿童发热性疾病的诊治将起到互补作用，如风湿发热CRP升高，PCT可能不升高或轻微升高，但要考虑到医疗成本、方法学限制等因素。有文献报道中有使用超敏C反应蛋白(hs-CRP)作为感染指标的观察，应注意超敏C反应蛋白的检测线性范围 。

《医》：儿童结核病 临床表现多样，使儿童结核病的诊断十分困难。而早期诊断和治疗，对儿童结核病的预后有着重要的意义，所以，人们一直在努力探索新的实验室检测方法。目前，您的实验室采用的是哪种方法进行检测，能不能给大家分享下检测价值？您是如何看干扰素 -γ释放试验在儿童结核病诊断中的作用的？
李贵霞：
        结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的诊断金标准是从患者体内标本分离出抗酸杆菌或结核菌培养阳性，但由于结核病患儿体液标本的细菌载量低，病原学培养及痰涂片阳性率很低，儿童肺结核病痰涂片阳性率仅为10％-15％，结核菌培养阳性率也<30％-40％，与成人结核感染的检查有明显的差别，使儿童结核病易过度诊断或漏诊，如不予以重视，可发生活动性结核病，所以有效的检测方法和结果判读对儿童结核病的诊治显得尤为重要。目前我们实验室的检测方法有涂片抗酸染色、分枝杆菌培养、结核抗体检查和γ-干扰素释放酶联免疫斑点试验（T-spot TB）。

        痰涂片抗酸染色找菌由于儿童咳痰留取困难，大多是唾液，而且目前标本的采集没有统一的标准和质量控制体系，使检验结果常不稳定，阳性率低，因此建议连续多次送检标本以提**性率；此外也可以采集胃液、支气管肺泡灌洗液（BALF）、脑脊液、淋巴结穿刺液等等涂片抗酸染色找菌，但总体阳性率都很低。

分枝杆菌培养阳性的应送到结核实验室做鉴定和药敏试验，对培养阴性的标本不应直接抛弃，建议取培养液用PCR方法做结核杆菌检查有可能阳性，我们曾有这样的病例，但是应该注意分枝杆菌培养阳性的培养液用PCR方法做结核杆菌检查有的试剂出现假阴性，给大家一个借鉴吧。

        血清结核杆菌抗体检测方法包括金标免疫斑点法、 ELISA法、免疫层析实验、免疫印迹实验和蛋白芯片技术等。我们采用的是结核蛋白芯片，该方法是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法，是以微孔滤膜为载体，将结核分枝杆菌的特异性抗原如LAM、相对分子质量 38000蛋白和相对分子质量16000蛋白等固定在其表面，利用微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，捕捉被检样品中的特异性抗体，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，结合胶体金作为标记物而直接在膜上显色，形成紫红色的斑点。显色后通过芯片识别系统进行分析、判定结果。操作中要注意溶血、脂血等可能影响显色或渗滤过程。LAM抗原是结核菌细胞壁的重要组成成分，结核菌的LAM水平明显高于其他分枝杆菌，与其他抗原相比有高表达的特性，并具有高免疫源性和高产量，敏感性和特异性均较高，重复性也很好；相对分子质量38000蛋白为结核分枝杆菌复合群特异性蛋白，是结核菌的分泌抗原之一，结核菌和卡介苗均产生相对分子质量38000蛋白，但前者水平显著高于后者，但其缺点是敏感性不高，20％-30％的结核病患者抗相对分子质量38 000蛋白阴性；相对分子质量16000蛋白为结核分枝杆菌复合群特异抗原， 主要存在予培养滤液中，相对分子质量16000蛋白的基因仅发现于结核分枝杆菌复合群，没有常见环境中的非结核分枝杆菌抗原表位，与常见的非结核分枝杆菌无血清交叉反应。结核蛋白芯片检测可对多种结核分枝杆菌抗原的抗体同时进行筛查，方便快捷，对痰涂片阴性、无痰的、肺外结核患者的诊断，有一定优越性。对其他方法的结核抗体检测，应明确包被的是那种抗原以便知晓其检测价值。无论哪一种血清结核杆菌抗体检测方法，均有一定的缺陷，存在早期敏感性不高以及假阳性结果的缺点，因此要结合临床症状和其他检查结果综合评价，不能片面地依赖其诊断或除外结核。

        干扰素-γ释放试验有斑点法和ELISA法二种，γ-干扰素释放酶联免疫斑点试验（T-spot TB）为体外测定结核菌抗原刺激诱发的T淋巴细胞分泌干扰素的方法。已致敏的T淋巴细胞当再次遇到结核菌抗原时引发其分泌产生IFN-Y，并使受结核菌感染的个体末梢血中单核细胞产生斑点，受检者血单核细胞的斑点数量，称为T-spot TB分析。结核菌感染后的效应T淋巴细胞，在受到MTB特异抗原早期分泌靶蛋白ESAT-6（early-secreted-antigenietarget-61）和培养滤液蛋白CFP-10（culturefil-trateprotein-10）刺激后可分泌IFN-Y，此ESAT-6和CFP-10蛋白源于结核菌基因组RDI编码的低分子质量蛋白，仅存在于MTB复合群中，不存在于其他分枝杆菌和BCG内，在卡介苗菌株和大部分环境分枝杆菌中缺乏，理论上能区分结卡介苗或MTB自然感染所致的结核菌素（PPD）试验阳性结果。因此干扰素释放试验的优点在于不受卡介苗接种的影响，因此被美国疾病预防控制中心（CDC）推荐作为卡介苗接种儿童结核感染检测的首选；因不受非结核分枝杆菌和其他细菌感染的影响，可用于结核病的鉴别诊断，如呼吸系统疾病与结核病的鉴别诊断、不明原因发热患儿结核感染排查、克罗恩病和肠结核的鉴别诊断等：受机体免疫学状态的影响较小．也可以用于艾滋病/结核病(HIV/TB)双重感染人群的检测、免疫抑制剂治疗前后的筛查、大剂量激素治疗前后的筛查等；此外检测过程短，24h即可得结果，不需要患者重返医院进行结果读取；结果读取避免了一定的主观性等。但该试验无法区分潜伏结核感染和活动性结核病。另外，由于该试验对操作技术要求较高、成本较高，因此可以作为PPD试验初筛后的补充方法，辅助临床医师排除PPD试验的假阳性结果，与非结核分枝杆菌感染和接种BCG阳性相区别，否为活动性结核病，则需要结合临床症状及其他检测指标综合判断。阴性结果提示测试样本中不含有针对MTB特异的效应T淋巴细胞。但当患儿存在免疫系统功能不全或免疫系统疾病或实验非正常操作引起的差异等，阴性结果并不能排除结核感染的可能。

        随着分子生物学和免疫学技术的快速发展，利用全自动聚合酶链反应(PCR)技术同时检测MTB和利福平（rifampicin，RIF）耐药的分子生物学检测方法—Xpert MTB/RIF试验，为儿童结核病快速诊断诊断提供了新方法，该试验对呼吸道标本检测的敏感度高，可作为痰涂片检测的有效替代方法，可用于非呼吸道标本的检测，包括脑脊液、胃液、组织、胸水、尿液、粪便等，因此对肺外结核病的诊断价值较高；同时还能检测利福平耐药情况，缺点是硬件要求较高、检测成本高，从而阻碍了其广泛应用。

《医》：新生儿以及儿童出系统处于脆弱的动态平衡，容易受到影响而发生出血以及血栓。实验室检验项目对于临床医生在出血以及血栓性疾病的诊断、治疗以及监测等方面起到重要作用。能不能给我们介绍下，您的实验室在此方面的项目开展？以及一些好的检测经验？
李贵霞：
        我们实验室开展的凝血项目有：凝血酶原（PT）、国际标准化指数（INR）、部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原含量（FIB）、D-二聚体、凝血VIII因子测定。我认为不仅要关注儿内科疾病凝血系统的变化，一般在儿内科患儿凝血系统异常都有原发疾病，能充分引起医生的关注，而在外科术前检查尤其门诊小手术时APTT时间延长不能简单认为可能是采血不顺利引起，更应提醒医生关注进一步检查凝血因子和血管性血友病因子(v WF)，避免遗漏血友病，引起术中出血和止血困难。新生儿及儿童的凝血和止血机能是逐步完善过程，对凝血项目的异常要考虑到生理特点、病理特点以及先天性、遗传性因素，血栓症时要考虑置入导管（尤其新生儿）、肿瘤等。

《医》：您的实验室在做不同年龄段儿童脑脊液胱抑素-C时，对不同含量差异如何判断？
李贵霞：
        胱抑素是胱氨酸蛋白酶的一种抑制剂，是由机体所有有核细胞产生，产生恒定，能够自由通过肾小球滤过膜，在近曲小管几乎被完全重吸收后又被完全分解代谢，不再重新回到血液循环中去，同时肾小管也不分泌，是反映肾小球滤过率变化的内源性标志物。胱抑素-C存在于各种体液之中，尤以脑脊液和精浆中含量为高。我们科仅检测血清胱抑素-C浓度，作为肾功能的一项检测指标，没有检测脑脊液胱抑素-C，因为没法获得脑脊液胱抑素-C的参考范围。就是新生儿血清胱抑素-C的参考范围我们也存在很大困惑，新生儿的胱抑素-C随肾功能的日益完善在不同日龄变化很大，尤其早产儿肾功能发育不同血清胱抑素-C浓度不同。如果做为观察窒息新生儿脑脊液胱抑素-C与疾病关系，不知道同条件的对照组如何选取？我也一直困惑这些问题，对发表的类似文章（如《中国全科医学》 2013年26期冯培的 “脑脊液中胱抑素C水平对新生儿窒息后脑损伤的诊断价值分析”不知道是如何选择同条件的对照组的？也希望高水平专家给予解答。

《医》：您觉得在儿童疾病检测技术上还需要哪些方面的发展？
李贵霞：
        儿童疾病起病急、发展快、门诊量大，家长心情急躁，快速、准确、操作简单的检测项目很少，有待进一步发展；在感染性疾病多重病原体检测上项目尚少，我们已经开展了病毒、肺炎支原体等11项病原体的多重测序检测，使用一年了对临床诊治帮助很大，希望能有常见细菌、难培养细菌以及真菌的多重分子生物学技术的发展；此外遗传代谢疾病、先天性免疫缺陷的筛查检测手段希望能推广，最好能有适合基层医院的检测技术。


来源：医学仪器与试剂