膀胱尿路上皮癌的诊断与随访，长期处在“效果可靠但侵入性强”与“无创方便但敏感性不足”的拉扯中。临床上，膀胱镜几乎是绕不开的金标准工具，却伴随费用、麻醉需求、操作者差异和不适感等问题；尿液细胞学检查更无创，但总体敏感性有限，并受感染、结石等因素干扰。如何在不增加患者负担的前提下，把肿瘤信号更早、更准地捕捉出来，是尿液液体活检被寄予厚望的根本原因。 Jain 等人在 Diagnostics 2026 发表的研究提供了一条可落地的路径：基于数字滴度PCR（ddPCR）构建“尿液肿瘤DNA检测面板”，在整份尿液样本中直接捕捉肿瘤相关热点突变，从而实现对膀胱尿路上皮癌的无创辅助诊断。该研究将检测目标聚焦于四个在尿路上皮癌中高频出现的基因通路节点，覆盖八个常见点突变位点，分别来自 TERT、GPR126、FGFR3 和 PIK3CA。结果显示，该面板在88例经组织学证实的膀胱尿路上皮癌患者中检出率达到78.4%，在72例非恶性对照人群中未检出任何突变信号，特异性达到100%，总体AUC-ROC为0.892。这组数据提示：以ddPCR为核心的尿液突变面板，在真实临床队列中已经具备“可用于诊断支持”的性能基础，也为随访监测减少部分膀胱镜检查次数提供了想象空间。
这篇研究的设计思路非常典型，值得做成“数字PCR应用案例”的模板来理解。首先是靶点选择逻辑：作者并没有追求“大而全”的多基因泛癌面板，而是围绕尿路上皮癌突变谱中“频率高、互补性好、适合ddPCR开发”的位点组合来构建。面板包含两类非编码区热点（TERT启动子两处突变、GPR126第6内含子两处突变）以及两类经典编码区驱动位点（FGFR3 S249C；PIK3CA E542K、E545K、H1047R）。作者明确指出，选择标准包括高频、较低基因型重叠度，以及在ddPCR体系中具备可开发性，例如一些高GC区域的非编码突变尽管常见，却不利于ddPCR探针体系构建，因此被排除。对准备做液体活检ddPCR面板的团队而言，这种“以临床收益和方法学可实现性共同约束”的策略，比盲目堆叠靶点更接近可转化落地。
第二个关键点是样本策略：研究使用的是整份尿液（whole urine），而非仅取上清中的游离DNA或仅取沉渣细胞DNA。作者基于自身经验强调，整尿处理通常能获得更高的DNA产量，尤其是尿路上皮癌患者常带有明显的细胞成分；并引用文献指出，同一患者尿液上清与沉渣中突变检出频率可能差异显著。换句话说，ddPCR能不能“检得出”，除了体系本身，更受制于前端样本如何定义与处理。这也解释了为何不同研究间尿液突变检出率范围很宽：不是ddPCR不稳定，而是样本分层与前处理路线不同导至“起跑线”不同。该研究从采集第一泡晨尿开始（50–100 mL），冻存于−80 ℃，并从4 mL整尿中提取DNA。为避免整尿中细胞颗粒导至柱堵，作者将裂解步骤额外延长20分钟，这种面向真实样本问题的工艺微调，是尿液类样本走向常规检测的关键细节。 第三个亮点是质量控制与判读阈值的处理。由于提取体系中含有大量载体RNA，作者认为用分光法评估DNA质量并不可靠，因此采用实时PCR进行样本质量门控，设置Ct小于32作为通过标准。ddPCR方面，样本未做浓度归一化，而是接受“尿液DNA天然异质性”的现实，并通过最低液滴数量作为重测触发条件：每孔少于10,000个液滴则重复反应。研究中可接受液滴数的均值约为20,347，体现了数据层面对可靠性的把控。更重要的是，作者为每个检测体系预先建立了假阳性液滴的截断值：对 pTERT、FGFR3 和 PIK3CA 体系，阈值设为每孔2个假阳性液滴；而 GPR126 体系由于假阳性与野生型DNA输入量相关，阈值改设为MAF的1.85%。并且作者在结果展示时将这些阈值从定量结果中扣除，以便临床解释更直观。这一做法提醒我们：液体活检ddPCR不仅是“有没有信号”，更是“在低MAF区间如何稳健地区分真实突变与体系背景”的工程问题，阈值策略必须和样本输入量、体系特性相匹配。
在临床表现方面，研究给出了多维度的可读结果。总体上，面板在尿液中对突变的检出分布为：TERT 54.5%，GPR126 37.5%，FGFR3 28.4%，PIK3CA 38.6%。这意味着单一基因并不足以覆盖大多数患者，而四基因组合带来了明显的互补增益。作者进一步报告，至少两种突变同时阳性的情况很常见，超过一半的患者在尿液中检出两种及以上突变。对临床来说，这一现象有两层意义：第一，面板式检测能降低“单靶点漏检”的概率；第二，多突变共存为后续风险分层、疗效/复发监测提供了更多可追踪的分子标记位点。 对于数字PCR读数的“量化指标”，该研究采用突变等位基因分数（MAF）作为核心输出，并给出了尿液tDNA拷贝数与MAF的高度变异性：UBC组尿液tDNA中位数约385.7 copies/mL，MAF中位数约10.0%。作者指出，当MAF处于低端（例如低于0.5%）时，出现假阴性的概率会明显上升，这也解释了为何理论上面板覆盖突变频率可达90%，但在尿液中实际检出率为78.4%。这对应用端非常重要：ddPCR面板在无创筛查或随访中表现优良，但“阴性不等于排除”，尤其在低肿瘤负荷、低脱落、低DNA总量或抑制物较多的场景，仍需结合影像与临床路径综合判断。
值得关注的是，作者还尝试把ddPCR量化信号与临床特征连接起来。研究显示MAF与多数人口学和临床特征无显著关联，但与肿瘤体积存在关系：肿瘤体积大于2.16 cm3的患者，其MAF显著更高。这一结果符合“肿瘤负荷越大，尿液中可检突变比例越高”的直觉，也提示了ddPCR在随访中可能更擅长捕捉“负荷变化”，而不是稳定对应肿瘤分期或分级。作者进一步比较了同时带有两种及以上突变样本中，不同基因突变的MAF差异，大多数基因对之间无显著差别，除FGFR3与PIK3CA这一对在小样本中出现差异。这种分析方式为“多靶点信号是否提示克隆演化先后”提供了一个探索入口，尽管仍需更大队列和组织对照来验证。 在方法学选择上，作者也给出了对ddPCR的定位：相较于测序，ddPCR成本更可控、对抑制物更有韧性，且在低MAF区间更稳健；不足之处在于同时可覆盖的靶点数量有限，因此面板没有纳入TP53、ERBB2等其他常见变异。作者提出的改进方向也很务实：将PIK3CA多个位点合并为筛查型单孔体系、扩展FGFR3多位点并合并筛查，以减少每个样本占用的孔数，从而为加入新的突变、甲基化、片段组学或拷贝数变异（CNV）等指标腾出检测空间。这些建议说明ddPCR在尿液液体活检中并非“与测序二选一”，而更可能以“高性价比、易标准化的靶向检测模块”形式长期存在，并与其他生物标志物形成组合拳。 综合来看，这项研究展示了数字PCR在尿液液体活检场景中的几项核心应用价值：以肿瘤特异性突变为抓手实现高特异性的无创检出；在真实整尿样本与异质性输入条件下，通过严谨的阈值与质量控制策略维持可解释性；输出可量化的MAF与拷贝数指标，为诊断支持与随访监测提供连续变量信号。对医院检验、分子诊断实验室以及希望开发尿液肿瘤标志物的团队而言，这篇文章不仅提供了一份性能数据，更提供了一套可复用的“ddPCR面板式液体活检”工程化范式。 引用文献 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
