随着秋冬季疫情再度反弹,新冠病毒的检测压力不减反增。国内各级医院检验科目前常用两种新冠病毒感染检测方法,分别是核酸与抗体检测。目前核酸检测针对的位点主要包含病毒基因组中2段或者3段保守基因序列,分别是开放读码框1a/b(open reading frame 1ab, ORF 1ab)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, N)以及包膜蛋白(Envelope protein, E)。检测过程中的采样时机、样本类型、人员操作、试剂敏感性以及病毒变异等因素,可能导至核酸检测出现假阴性结果。 通过新冠病毒的S蛋白和N蛋白等刺激机体免疫系统所产生的抗体来进行血清学检测是临床上常用的另一种检测手段。从急性感染的一般过程来说,IgM抗体的出现早于IgG;当IgG出现后,滴度会持续增高,存在较长时间;IgM则持续降低,直至消失。因此,IgM和IgG是一对出现有序、此消彼长的标志物。正确地观察两者的动态变化,有助于在核酸检测假阴性的情况下,进行新冠病毒感染的诊断[1]。抗体检测在新冠肺炎的有效防控与及时诊治过程中发挥了重要作用,但其假阳性率较高也在一定程度上困扰着临床决策,因此是否进行抗体检测备受争议。 一 核酸漏检并不罕见 根据厦门卫健委公布的新冠疫情数据统计,从2020年5月21日至2020年10月31日,入厦人员中共筛查出107例核酸阴性、抗体阳性的病例,随后多次检测核酸,最终核酸检测阳性确诊。从2020年10月开始,我国驻多国大使馆也相继发布通知,乘机赴华人员需持有核酸与抗体“双阴性”证明,两者缺一不可。 疫情防控过程中,核酸漏检的情况并不罕见。武汉中南医院曾报道过一例具有发热患者接触史、典型新冠肺炎症状以及CT表现的新冠患者。虽然该患者IgM和IgG阳性,但整个诊疗期间核酸检测始终阴性(下图)[2]。 近期沈阳也通报了一例以IgM和IgG抗体阳性作为诊断依据,结合患者流行病学史及临床症状进行确诊的病例。 可以得出: 抗体检测作为核酸检测的重要补充,有助于对疑似感染者或重点高危地区人群的辅助筛查;抗体与核酸联合检测能够有效避免漏检。 这体现了国内检验学者对不同方法学检测价值的认可,背后是对整个疫情防控的全面重视。在检测前端,国内IVD企业承担起了巨大责任,有些企业甚至能为检验科和第三方实验室提供包含核酸与抗体的全面解决方案,例如迈克生物。 二 新冠抗体检测的研究进展 在新冠疫情爆发早期,我国学者便发现新冠病毒能够刺激机体产生三种类型的免疫球蛋白:IgM、IgA和IgG;约90%新冠患者在临床症状出现后的1周内出现IgM和IgA血清学转换;大部分患者的IgG在10-18天发生血清学转换(下图A)。临床症状出现后,随着时间延长,核酸检测阳性率逐渐降低,IgM阳性率逐渐升高;临床症状发生后5-6天,IgM的阳性率超过核酸阳性率(下图B-C);IgM联合核酸检测,能够有效提高新冠病毒感染的诊断效率(下图D)[3]。 重庆医科大学黄爱龙教授课题组对285例新冠患者血清样本的横断面研究发现,抗体滴度随发病时间呈现逐渐增高趋势(下图A),重症患者的IgG和IgM水平较非重症患者高(下图B);同时,症状出现后随着时间推移,IgG和IgM阳性率呈升高趋势,发病后17-20天,IgG阳性率可达100%;而IgM阳性率在发病后约20-22天,也高达94.1%(下图C)。他们认为,抗体检测有助于疑似病例的早期确诊及SARS-CoV-2真实感染的流行病学调查[4]。 与此同时,该课题组在无症状感染者以及有症状患者队列中均观察到抗体水平的快速下降,约90%的患者出院后2个月内抗体水平降低70%以上(下图),提示血清学检测应尽早进行[5]。 此外,有学者对175例轻症康复的新冠患者血浆进行检测之后发现,新冠病毒的中和抗体不会和SARS病毒发生交叉反应;从发病的第10至15天,患者血浆中可以检测到特异性中和性抗体,中年(40-59岁)和老年患者(60-85岁)血浆中抗体含量显著高于青年患者(15-39岁)(下图)[6]。 以上研究似乎能得出一个结论: 抗体浓度过高,反而提示疾病更严重?这可能是因为机体的免疫应答类似一把双刃剑,既可以清除病毒,也能够促进病毒对自身的伤害,例如诱发细胞因子风暴,免疫系统攻击自身器官,导至多器官功能衰竭。 三 抗体检测的影响因素 目前的研究表明,IgM和IgG抗体假阳性率较高,而造成检测结果假阳性通常由以下两方面因素所导至: 1. 试剂盒cut-off值的设置,一些处于cut-off附近的弱阳性结果,很可能是假阳性; 2. 标本中存在的内源性或外源性干扰物质。 尽管从方法学设计及临床应用中,采取相应措施可以减少IgM和IgG的假阳性,但仍无法完全避免[1]。 抗体检测假阳性的干扰因素 与此同时,导至抗体检测假阴性的情况则较少,主要包括以下几种情况: 1. 采用EDTA抗凝的血浆样本,EDTA可抑制HRP活性,导至假阴性; 2. 试剂盒未按要求存放,导至酶活性降低; 3. 检测操作不规范,如试剂从冰箱取出后未待室温平衡就进行检测。 在抗体结果的评价过程中,还应关注免疫缺陷病和使用免疫抑制剂的受检者,这类人群可能存在某种或多种类型的免疫球蛋白缺乏,感染后无法产生正常的免疫应答反应。此时需结合核酸检测、流行病学调查、其他实验室检测结果以及临床症状等进行综合判断。 核酸与抗体联合检测结果解读 四 不同检测方法对新冠抗体检测能力对比 武汉大学中南医院的研究人员纳入了191例就诊于武汉雷神山医院的确诊和疑似新冠患者,根据入院及抗体测定时的核酸检测结果分为持续阳性组(入院时核酸阳性,至血清采集时持续阳性)、阳转阴组(入院时核酸阳性,至血清采集时核酸转阴)及疑似组(入院时核酸阴性,至血清采集时持续阴性),并以27例排除新冠感染的患者作为对照组。采集其血清样本,分别用胶体金和化学发光法检测各组IgM+IgG总抗体及IgM抗体,比较两种方法检出率的差异。 研究发现: 持续阳性组中,胶体金法与化学发光法无明显差异;而阳转阴组和疑似组中,化学发光法的阳性检出率明显优于胶体金法[7]。 国外学者也汇总比较了ELISA(酶联免疫吸附),LFIA(侧流免疫层析,LFIA检测试剂盒多以胶体金、彩色乳胶颗粒或荧光素作为标记物)以及CLIA(化学发光免疫分析)三种方法对新冠抗体检测的准确性。其研究表明,现有证据并不支持继续使用以LFIA原理进行新冠病毒的血清学检测(”Current evidence does not support the continued use of existing point-of-care covid-19 serology tests with the LFIA method“)[8]。 五 结语 之前发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》已指出:一般不单独以血清学检测作为诊断依据, 需结合流行病学史、临床表现和基础疾病等情况进行综合判断。但对临床怀疑新冠肺炎且核酸检测阴性的患者以及病情处于恢复期且核酸检测阴性的患者可以通过抗体检测进行诊断[9]。 因此,对新冠抗体检测有如下建议: 1. 单独的抗体检测不能作为新冠病毒感染的确诊和排除依据,但对高风险地区人群筛查具有重要意义; 2. 抗体检测结果的解读,需结合核酸检测结果; 3. 定量方法为检测首选,同时随访必不可少。 附: 部分数据来源:李雪寒,赵瑾,潘运宝,李一荣.新型冠状病毒特异性抗体检测现状及应用思考[J].中华检验医学杂志,2020,43(07):691-696. |