新型冠状病毒（SARS-CoV-2）实验室检测策略

分享一篇综述，关于SARS-CoV-2基因组特征以及相关检测原理与细节。

在COVID-19的不同阶段，不同检测的效果差异很大。RT-PCR核酸检测在感染早中期阶段较灵敏，血清学检测则可能识别感染后期阶段，可作为核酸检测阴性但疑似感染者的辅助检测手段。

多地突发疫情，面对即将到来的春运，大家都做好了“备战”的准备，为避免出现“假阴性”，造成误诊或漏诊，在病毒检测时应采用多指标联合，以弥补单一方法的不足。

实验室检测一直是诊断COVID-19的重要手段，在疫情防控中发挥着重要作用。在实验室检测中，不同感染者的病毒载量存在差异，同一感染者呼吸道不同部位以及不同发病时期的病毒载量也存在差异。

如图1所示，大多数患者的发病初期、进展期和恢复期平均天数，分别为4d（第2～6d）、12d（第7～19d）和20d（第10～33d）。最初几天，病毒迅速复制，并在早期或进展期达到高峰（约104拷贝/mL～107拷贝/mL），随后迅速下降，而在恢复阶段，大部分病毒复制量低于104拷贝/mL，感染病毒的总时间约为20天。在不同阶段，不同的实验室检测对SARS-CoV-2的特异性与灵敏性不尽相同。

随着对新型冠状病毒肺炎的认识和实验室技术的不断提高，新型冠状病毒肺炎的诊断方法也由单一的病原学证据，转向病原学和血清学证据相结合的综合诊断（图1）。按照《新冠状病毒肺炎诊疗方案（试行版第七版）》，（1）RT-PCR核酸检测；（2）病毒基因序列测定；（3）COVID-19血清特异性IgM、IgG抗体检测；符合其中1项阳性者即可被诊断为SARS-CoV-2感染阳性。

图1、SARS-CoV-2实验室检测策略

注：大多数SARS-CoV-2感染者在起病后4～48h内核酸检测阳性，大多于5～7d达到高峰，后随病情的好转下降。IgM和IgG在发病后4～7d和6～14d出现血清学改变，在症状发作后的19～21d内达到峰值。

通过基因测序和生物信息学的结合，可以快速获得病毒的基因序列并进行识别。

病毒基因测序的最大优势是对未知样本的确定，因此在传染病爆发初期确定感染源具有重要价值。对于SARS-CoV-2，基因测序具有很高的准确性，是临床诊断的重要手段。通过对病毒基因序列的分析，能找出不同毒株的同源性，鉴别其来源，分析其演化过程，跟踪其突变情况，从而为疫情的控制提供依据。

但是，由于其配置要求高，耗时长，成本高，操作人员技术要求高，使其不能作为疾病暴发时的快速检测手段。

实时逆转录–聚合酶链反应（RT-PCR）灵敏、特异性强、易于普及推广，该方法成为此次疫情防控中的首推的确诊检测方法。

RT-PCR核酸提取，采集人鼻咽试子或咽拭子，提取核酸并将其纯化，然后进行实时RT-PCR，在此过程中RNA被反转录成cDNA，然后用特定的引物和探针进行扩增和检测。

SARS-CoV-2属于包括MERS、SARS-CoV等一类冠状病毒。而其他的冠状病毒也可能会引起与SARS-CoV-2相似或相同的症状。因此，基于PCR的病毒检测需要使用SARS-CoV-2特异的引物和探针，这些引物与探针须与其他冠状病毒序列没有同源性。

随着疫情的进一步发展，越来越多的SARS-CoV-2基因在引物或探针结合位点上发生突变，这可能会影响到现有的RT-PCR检测的N基因、E基因和ORF1a/b基因的灵敏性。

由中国疾病预防控制中心发布的特异性扩增区域，其诊断灵敏度为77.7%（95%CI=71.5%～84.9%），而特异性则为98.8%（95%CI=93.3%～100%）。对COVID-19患者进行RT-PCR检测后发现了明显的假阴性率，可能会漏诊15%～29%的COVID-19患者。

为降低COVID-19检测的假阳性和假阴性，研究者们针对RT-PCR方法进行了优化。利用序列无关单引物扩增（sequence-independentsingle-primeramplification，SISPA）和纳米粒全基因组测序，建立了一种新的nsp1 RT-PCR方法。其引物和探针对SARS-CoV-2具有较高的特异性。该方法的灵敏度为93.1%（95%CI=86.2%～97.2%），与N基因、E基因RT-PCR法灵敏度基本一致，诊断特异性为100%（95%CI=92.9%～100%）。

在SARS-CoV-2中使用nsp1进行多靶点检测，可以避免现有RT-PCR检测引物或者探针结合位点突变引起的假阴性结果。

由部分学者进一步优化的COVID-19-nsp2无水解探针检测试剂与传统的COVID-19-RdRp/Hel检测方法相比，具有100%的诊断灵敏性和特异性。

与PCR检测不同，抗体检测并不是用来识别SARS-CoV-2活动性感染。抗体测试并非检测咽或鼻拭子中的病毒遗传物质，而是揭示大多数人的免疫反应。

在感染者开始感到不适≥1周或症状可能已经消失后，血液中才会出现IgM和IgG抗体。IgM和IgG可以为核酸检测阴性而疑似COVID-19患者提供一种快速、简便、准确的辅助检测方法。

检验试剂不可靠、检验操作不规范是误诊的主要原因。

在使用RT-PCR法检测COVID-19时，因鼻咽拭子采集标本的可操作性，在临床上常被采用，标本保存后运送到实验室检测。在此过程中，不同人的操作会对检测结果产生一定的影响，导至假阳性或假阴性的出现。

感染者出院后出现复阳现象的主要原因是样本采集不当、病毒载量痕量以及治愈后再感染。据报道，如果患者在出院前进行的一项检查是阴性的，那么这个结果有14.60%可能是假阴性。按照连续2次SARS-CoV-2核酸检测阴性方可出院的原则，2次均为假阴性的几率为2.13%（14.60%×14.60%）。此外，由于RNA病毒具有很强的遗传变异性，突变引起的引物与目标序列不匹配也会导至检测性能差和假阴性。

总而言之，为提高SARS-CoV-2检测阳性率，需要防止样品中RNA降解，对感染者多部位进行同时采样，影像学或血清学检查为辅，以避免出现“假阴性”，造成误诊或漏诊。

目前，“RT-PCR核酸检测+血清抗体检测”是目前诊断COVID-19的主要方法。核酸检测阳性而抗体阴性，提示患者正处于病毒感染的“窗口期”，IgM阳性提示患者可能处于感染的急性期，IgG阳性提示患者处于SARS-CoV-2的感染中后期或既往感染SARS-CoV-2（图1）。

但无论是核酸检测还是血清抗体检测，都可能出现假阴性和假阳性，需要多次检测才能确认。

文献来源：董文学,李靖,张致英,赵志鹏,杨旭,康龙丽.新型冠状病毒（SARS-CoV-2）实验室检测策略[J].中国公共卫生.doi:10.11847/zgggws1132725