DNA测序界的等待：手持式低成本纳米孔测序仪

幸福侠侣

       美国佛罗里达州的Marco岛（Marco Island, Florida）是基因组测序者们的圣地，十几年来，这里每年都会举行一次基因组测序盛会，全世界的基因组测序仪制造商们都会在会上拿出他们最先进的技术和产品，其中有很多都是革命性的创新技术。最近最吸引人的就是英国牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies）在两年前发布的技术，他们能够进行实时测序，而且拥有非常长的读长，这项技术只需要让待测DNA分子通过一个纳米级的孔道就行了（Science, 4 May 2012, p. 534），在此之前很多人都认为这是不可能完成的任务。牛津纳米孔技术公司表示他们会尽快推出原型机，让广大科研工作者都享受到技术进步带来的便利。

       经过了两年多的沉寂，他们最终给出了答卷。虽然该公司并没有派人参加这次的大会，但是据一位与该公司有合作的科研人员介绍，他们已经用这种新技术对一种细菌进行了基因组测序，而他本人也使用测序结果组装出了细菌的完整基因组序列。并且牛津纳米孔技术公司也在积极兑现承诺，通知科研人员们对他们的新设备进行测试。不过并不是所有人都认可该公司的这第二步棋，因为他们得到的测序数据的质量并不高，单单靠这些数据是不可能获得完整基因组序列的。

       与此同时，传统的测序仪也在飞速地发展，希望进一步降低测序服务的成本。比如全世界最大的测序仪制造商Illumina公司就在今年1月登上了头条，因为他们宣称将推出一台新产品，能够将个人基因组测序的成本降低到1000美元这个具有重要意义的分界线，因为很多人都认为如果个人基因组测序的费用能够降低到这个水平，将使测序成为一项临床常规检测手段（Science, 17 March 2006, p. 1544）。

       Illumina公司推出的这台新设备与其它新一代测序仪（next-gen sequencers）一样，采用的也都是合成测序策略，即在新DNA链合成的时候检测出被添加上的碱基。这些碱基必须加上化学标签（修饰物），以方便辨认。采用这种技术测得的片段读长都很短，需要进行后续拼接。而牛津纳米孔技术公司采用的测序策略则完全不同，他们使用的是实时测序方法，让一根DNA长链穿过纳米级别的孔径来完成测序。当DNA链上的碱基通过纳米孔时，它们会阻断纳米孔中的离子流，而每一种碱基引起的变化都不相同，因此就可以判断出碱基的序列。从理论上来说，这种技术的测序读长可以达到数千bp，不会产生延迟，也不需要进行事后的序列拼接。这项技术提出距今已经过去了接近20年，最终于2012年成为了现实。当时牛津纳米孔技术公司提交了一份病毒基因组序列，据称就是使用纳米孔技术测得的。

但为什么后来就没动静了呢？

       据牛津纳米孔技术公司介绍，这两年来他们一直在寻找一种新型的基质膜来为纳米孔提供支撑，因为最开始使用的基质膜不适宜进行大规模制造。他们也调整了产品开发策略，放弃了最开始计划的大型测序仪开发计划，转而投向开发小型手持式、一次性测序设备，因为他们感觉这块市场需求更大。

       美国马萨诸塞州博大研究所（Broad Institute in Cambridge, Massachusetts）的David Jaffe在今年也透露一些新进展。他们课题组对大肠杆菌（Escherichia coli）这种常见的细菌和Scardovia wiggsiae（这是一种与牙齿腐烂相关的细菌）细菌进行了基因组测序，由他们提供DNA样品，牛津纳米孔技术公司完成了测序工作。这两种细菌的基因组长度分别为460万bp和155万bp。该工作表明牛津纳米孔技术公司的测序技术已经从两年前的病毒基因组水平提升到了细菌基因组水平。

       但是Jaffe的内幕消息也证实牛津纳米孔技术公司还有很长的一段路需要走。该公司提供的数据证明纳米孔测序技术的确拥有相当大的读长优势，几乎可以对一段DNA样品进行完整测序，一次最多能够得到10kb的序列。不过虽然有如此完美的数据，但是系统误差却让Jaffe等人无法将这些大片段拼接成完整的基因组序列，而这也是纳米孔测序技术的终极目标。不过Jaffe等人发现，可以使用这些纳米孔测序数据对常见的Illumina测序仪获得的基因组序列进行优化。美国马里兰州美国国立人类基因组研究院（National Human Genome Research Institute in Bethesda, Maryland）的Jeffery Schloss表示，虽然这种技术还处于初级阶段，但是在某些方面已经表现出了很强的应用优势。不过其他人却没有这么乐观，比如加拿大蒙特利尔麦基尔大学（McGill University in Montreal, Canada）的基因组学家Ken Dewar就指出，如果纳米孔技术只能够对现有技术起到修补作用，那么开发一台手持式的纳米孔测序仪有什么意义呢？

       牛津纳米孔技术公司目前正在邀请科研人员们自己来验证纳米孔测序技术的实力。就在Jaffe透露消息的当天，该公司就向全世界发出了电子邮件，邀请数百位申请者来体验他们的便携式测序仪MinION，只需要缴纳1000美元押金即可。首先这些试用者需要先用牛津纳米孔技术公司提供的DNA样品进行预试验，熟悉仪器操作等流程，然后就可以对任意的DNA进行测序。

       美国加州大学圣克鲁兹分校（University of California, Santa Cruz）的David Deamer是纳米孔测序技术的先驱，他可早就等不及了，他指出，大家可以有很多样品拿来试用。我们可要好好地‘虐’一下这台仪器。比如有人会用来对食品进行快速检测，看看是否存在有害微生物污染，也有人会想看看MinION能否测出古老的DNA。Deamer还想看看这台仪器是不是能够一次读出16kb的序列。

       就在牛津纳米孔技术公司大肆推介这种低成本的手持式测序仪的同时，Illumina公司也没有坐以待毙，他们决定反其道而行，推出了一款专门供超大型测序中心使用的最高级的测序仪。就在上个月，Illumina公司推出了价值数百万美元的HiSeq X，这台测序仪在一年的时间内能够测得1800个人的基因组序列，据该公司介绍，这将使个人基因组测序成本下探到1000美元以下，而且耗费的人工、仪器折旧和试剂成本都将大幅度降低。据Illumina公司的市场部高级经理Joel Fellis介绍：“我们看到大规模测序的需求在逐年上升。比如英国就计划到2017年时为全英国10万人进行个人基因组测序。”

       不过事情可没有这么简单。任何有计划购买HiSeq X的客户必须一次订购10台以上的设备，而且必须承诺只能将这些设备用于个人基因组测序。美国加州大学圣克鲁兹分校的生物工程师Zak Wescoe表示，这已经超出了绝大部分科研人员能够承受的费用。而且这些设备只有满负荷运转时才能够将个人基因组测序的成本压低到1000美元的水平。美国华盛顿大学基因组研究院（The Genome Institute at Washington University in St. Louis）的副主席Elaine Mardis也认为，可没有太多地方每年都能够提供1.8万人的个人基因组测序需求，也没有这么大的数据分析能力，所以Mardis这样评价道：“我不知道有谁会买这些测序仪。”

       Deanna Church是美国加利福尼亚州门罗公园Personalis公司（Personalis in Menlo Park, California）的基因组学家，他对技术进步带来的成本降低非常欢迎。他说道：“在这块市场中将出现好几个竞争者，总有一些技术会最终胜出。”