戊型肝炎患者血清ORF2抗原的检测及临床意义

临床医师

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus,HEV)感染引起的一种病毒性肝炎。我国是戊型肝炎的主要流行区之一,近年来戊肝发病率有上升趋势。戊型肝炎以急性肝炎为主,也可引起重症肝炎。免疫功能低下的患者感染HEV后,可发展为持续性感染和慢性戊型肝炎。急性戊型肝炎的临床表现与甲型肝炎类似,典型的特征为一过性的病毒血症和转氨酶升高。戊型肝炎的潜伏期为15-60d,发病后1wk左右血清中能够检测到HEVRNA,3-4wk后HEVRNA消失;粪便中HEVRNA的出现和消失都稍晚于血清,持续时间2-3wk;发病后转氨酶水平升高,一般3wk左右恢复正常。由于戊型肝炎与其他急性病毒性肝炎的临床表现类似,需要通过病原学检测进行确诊。

目前急性戊型肝炎的实验诊断比较常用的方法是应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的抗HEVIgM抗体,或对抗HEVIgG抗体进行动态检测。但由于病毒抗体的产生需要一定时间,一些患者就诊时可能尚处于病毒感染的“窗口期”,即已有病毒血症但并不能检测到抗体,因此PCR检测血清中的HEVRNA有助于急性戊型肝炎的早期诊断。HEV慢性感染通常发生在免疫抑制患者,由于免疫力低下,抗体的产生受到影响,患者体内虽然有病毒,但可能检测不到抗HEV抗体,因此慢性戊型肝炎的诊断主要依靠对HEVRNA的检测。虽然HEVRNA检测是诊断HEV感染的可靠方法,但由于进行RT-PCR的样本保存条件要求高、检测程序复杂、检测成本高以及易污染产生假阳性等原因,在实际临床诊断中很少应用。病毒抗原检测的方法易操作、成本低,已成功用于一些病毒性疾病的诊断中。HEV感染后在血清和粪便样本中能检测到HEV抗原,我国已经开发了HEV抗原(HEV-Ag)ELISA试剂盒。本文旨在研究戊型肝炎患者血液中HEV-Ag的出现与HEVRNA的相关关系,分析HEVORF2抗原检测在戊型肝炎临床诊断中的意义。

我国是戊型肝炎的流行区,许多地区曾有规模不等的戊性肝炎的暴发流行,近年散发病例的报告数有增加趋势。长期以来,戊型肝炎的特异性诊断主要应用ELISA方法检测抗HEVIgM和IgG抗体。抗HEVIgM检测灵敏度较高、方法简便、易于操作,但若初诊患者采血时间在HEV感染窗口期,HEV抗体未产生,ELISA检测则无法给出可靠的检测结果。而核酸可在HEV感染的早期或窗口期检出,有利于HEV感染的早期诊断。与2008年卫生部制定的《戊型病毒性肝炎诊断标准》(ws301-2008)相比,中国医师协会2009年制定的《戊型病毒性肝炎诊疗规范》中HEV急性感染的诊断指标增加了HEVRNA的检测:在诊断为急性肝炎的基础上,(1)血清HEVIgM阳性;(2)急性期和恢复期血清具有HEV-IgG抗体滴度4倍及以上增长;(3)血清和/或粪便HEVRNA阳性,三项指标中一项阳性即可作为急性戊型肝炎的诊断依据。

本研究中,有5例患者入院时初次检测抗HEVIgM和IgG均为阴性,但HEVRNA检测为阳性,1wk后抗HEVIgM检测结果均转为阳性,这个结果与以前的报告一致,表明在抗HEV抗体出现之前,一些患者血清中即可检测到HEVRNA。

虽然血清中RNA的检测有助于急性戊型肝炎的早期诊断,但目前应用PCR检测HEVRNA在临床诊断中很少应用,其原因除了检测结果不稳定,容易出现假阳性或假阴性外,更主要的原因是样本采集及及保存条件要求严格、实验操作程序复杂及检测成本高。而HEV-Ag检测则简单、易操作、成本低。目前HEV-Ag检测主要针对HEVORF2抗原。HEV病毒基因组包含3个开放读码框(ORFs),分别编码三种蛋白分子,其中ORF2蛋白为病毒衣壳蛋白,在病毒感染、吸附、入侵及包装等一系列病毒活动过程中具有重要作用。研究发现戊型肝炎患者和感染HEV的实验动物血清和粪便中能检测到ORF2抗原,并且ORF2抗原的出现与HEVRNA的存在具有相关性,提示检测到的ORF2蛋白可能是存在于病毒体的成分,而非游离于病毒体外,因此HEVORF2抗原阳性可能代表样本中有HEV的存在,ORF2抗原可以作为HEV感染的一个重要标志物用于戊型肝炎临床实验诊断。本次研究在116例戊型肝炎患者中64例血清HEVAg阳性,阳性率为55.2%,其中5例在感染早期抗-IgM尚未出现之前,血清中同时检测到了HEVRNA和HEV-Ag,表明HEV-Ag检测可能能够替代HEVRNA用于戊型肝炎的早期诊断。随着血清中抗HEVIgM、HEV-IgG出现时,HEV-Ag检出的阳性率逐渐下降,其变化规律与血清中HEVRNA的变化规律相同,显示这两种检测指标具有关联性,这一结果也与最近报告的一些研究结果一致。

在116例患者入院时进行HEV感染标志物检测,其中HEV-Ag与HEVRNA均为阳性41例,均为阴性51例,两项指标检出的一致率为78.5%(91/116)。应用Kappa指数,Kappa指数为0.582,显示两种检测结果一致性较好。对HEVAg阳性的64个样本ELISA检测S/CO值进行分析,总体上看来42个HEVRNA阳性样本的S/CO值高于24个HEVRNA阳性样本的S/CO值,进一步表明HEVRNA与HEV-Ag检测结果具有较强的关联性。

本次实验的116个样本中HEV-Ag和HEVRNA的阳性率分别为55.2%和35.3%,血清样本HEV-Ag的检测率高于HEVRNA(2=21.2,P<0.01)。PCR检测的灵敏度受很多因素影响,前期的研究显示RT-Nested-PCR灵敏度低于RealtimePCR。但由于Real-timePCR检测成本更高,RT-Nested-PCR检测HEVRNA在临床检测中的使用更为普遍,因此本研究应用了RT-Nested-PCR与HEV-Ag的检测进行比较。目前我国人群中流行的HEV主要为基因4型,在一些地区还有1和3型。为了能够检测到不同基因型HEV,同时保证检测的灵敏度,本次研究中应用RTNested-PCR扩增ORF2区域348nt的基因片段进行HEVRNA检测,所用引物为保守区域的简并引物,能够检测1、3、4型及兔HEV。

     总之,本研究显示戊型肝炎患者血清HEVAg检测与HEV检测结果一致性比较好。在不具备核酸检测条件时,可检测HEV抗原作为IgM抗体检测的补充,有利于急性戊型肝炎的早期诊断以及慢性戊型肝炎的确诊。


来源：世界华人消化杂志