论文导读｜基于RT-ERA的“样本进-结果出”一体化快速检测体系的构建

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论文：《A RT-ERA-CRISPR/Cas12a assay for rapid point-of-care duck hepatitis A virus detection》

影响因子IF：4.2

期刊：《Poultry Science》

团队：四川农业大学动物医学院禽病研究中心

该研究将RT-ERA与 CRISPR/Cas12a 系统结合，开发出 DHAV-1 的床旁检测方法，建立了荧光检测和侧向流检测两种模式，解决了传统方法依赖专业设备和人员的痛点，为现场快速诊断提供了兼具科学性与实用性的新技术方案。

一、技术路线与实验流程

本研究构建了一套“样本进-结果出” 的一体化检测体系，以先达基因（GenDx Biotech）RT-ERA 试剂盒为等温扩增核心，整体流程实现 “单管闭环、60 分钟完成”，具体设计如下：

靶标高效扩增：基于 DHAV-1 的保守序列设计特异性引物和 crRNA，核心扩增环节采用先达基因 RT-ERA 试剂盒，20分钟内即可将样本中极微量的病毒RNA高效扩增为DNA。

信号高敏检测：将扩增产物与CRISPR/Cas12a系统混合。Cas12a在识别特定靶标序列后，会被激活其“反式切割”活性，无差别切割体系中的单链DNA报告分子。通过报告分子上标记的荧光基团（荧光法）或荧光与生物素（试纸条法），即可通过便携仪器或肉眼直接判读结果。

二、实验关键结果

• 灵敏度与特异性双优：依托先达基因 RT-ERA 试剂盒的高效等温扩增能力，荧光检测模式的最低检出限（LoD）达 10 copies/μL，远超传统等温扩增技术；且仅对 DHAV-1 产生特异性信号，与 DHAV-3、鸭圆环病毒、鹅细小病毒等 7 种常见禽病原体无交叉反应，有效避免误诊。
  
  

• 临床验证表现优异：32 份临床样本经荧光检测模式验证，与 RT-PCR 的一致性达 93.75%（23 份真阳性、7 份真阴性）；另 32 份样本经侧向流试纸条检测，一致性达 81.25%，满足基层现场 “肉眼判读” 的需求。
  
  

• 操作便捷性突出：全程无需大型仪器，仅需恒温设备（或简易保温装置），从样本 RNA 提取到结果判读的完整流程控制在 60 分钟内，完全适配非实验室场景。
  
  

三、技术核心优势：

• 等温扩增效率稳定：先达基因 RT-ERA 试剂盒无需复杂温度变化，在 37-42℃宽温范围内均可实现高效逆转录与扩增，解决了传统 PCR 对精密仪器的依赖，为 POCT 场景提供了可行性。
• 兼容性与特异性优异：该试剂盒与 CRISPR/Cas12a 检测体系无缝衔接，扩增产物可直接触发 Cas12a 的反式切割活性，未出现非特异性扩增干扰；搭配特异性引物后，进一步强化了对 DHAV-1 的靶向识别能力。
• 场景适配性广：既支持实验室荧光定量检测，也可通过侧向流试纸条实现 “阳性双条带、阴性单条带” 的可视化判读，兼顾科研与基层应用需求。
  

四、未来展望

先达基因 RT-ERA 试剂盒在本研究中展现的高效扩增、稳定兼容特性，为开发下一代现场即时分子诊断产品提供了坚实可靠的核心组件，有望在公共卫生安全领域发挥越来越重要的作用。