科研｜高灵敏度一步法 ERA/Cas12a 系统构建：依托先达基因 ERA 技术的反应动力学优化

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OPERA-Cas12a: A streamlined one-pot system for specific and sensitive on-site detection of nucleic acids
发表期刊：《Sensors and Actuators B: Chemical》
影响因子：7.7
在食品质量安全领域，肉品掺假是长期困扰监管和消费者的难题 —— 比如牛肉丸里混入猪肉、鸭肉冒充羊肉，传统核酸检测需分 “扩增 - cleavage” 两步操作，不仅耗时（常超 90 分钟），还因样本转移易产生气溶胶污染，导至假阳性。而近日发表在《Sensors & Actuators: B. Chemical》的研究，提出了一套单管核酸检测系统，直接将两步反应合并，实现 6 拷贝 / 反应的超高灵敏度，60 分钟出结果，还能用手机可视化读数。今天就带大家拆解这项 “既快又准” 的检测技术。

一、传统检测的 “痛点”：两步法难破 “效率 - 污染” 困局
CRISPR/Cas 技术虽已成为核酸检测的 “利器”（如 Cas12a 可特异性切割靶 DNA 并激活旁切活性），但传统方案必须分两步：
1.先通过 PCR/RPA/ERA 等技术扩增靶核酸；
2.再将扩增产物转移到 Cas12a 反应体系中检测。
这种操作不仅延长检测时间，更致命的是 —— 转移过程中，扩增产物形成的气溶胶会污染其他样本，导至假阳性；且依赖实验室设备，无法满足屠宰场、市场等 “现场快检（POCT）” 需求。
论文的核心突破：将 “酶促重组扩增（ERA）” 与 “Cas12a cleavage” 整合到同一反应管中，关键是通过优化试剂配比，平衡两者的反应动力学 —— 既不让 Cas12a 过早切割引物（影响扩增效率），也不让其过晚启动检测（延长耗时）。

二、科学优化：用 DSD 策略 “精准锁定” 最优参数
要让两个 “互斥” 的反应在单管内共存，需找到关键试剂的 “黄金浓度”。作者没有采用传统的 “单因子变量法”（效率低、易遗漏交互作用），而是用了三阶确定性筛选设计（DSD） —— 一次性优化 6 个核心因子（引物浓度、Cas/crRNA 浓度、KCl 浓度、Tris-HCl 浓度、pH 值、Mg²+ 浓度），高效定位最优条件。

三、关键因子 “大起底”：这 3 个成分决定检测成败
在 DSD 优化前，作者先通过 “变量筛选实验”（图 1），揪出了对反应影响最大的 3 个核心因子，为后续优化缩小范围：
1.pH 值（图 1A）：pH 8.0 时荧光信号最强，过酸（<7.5）或过碱（>9.0）会直接抑制 Cas12a 的核酸酶活性；
2.Mg²+ 浓度（图 1F）：Cas12a 的活性依赖 Mg²+，但浓度超过 2mM 后，会抑制 ERA 的 DNA 聚合酶活性，导至扩增效率下降；
3.单价盐（图 1B/C）：KCl 选 55mM，既能促进 ERA 的引物结合，又不会干扰 Cas12a 的旁切活性（其他单价盐如 NaCl 效果更差）。
其他因子（如 Tris-HCl 浓度、缓冲液类型）对反应影响较小，可固定为常规值，进一步简化优化流程。

四、实战性能：
6 拷贝能检出，0.5% 掺假逃不掉
优化后的系统，在猪肉、鸭肉检测中均表现出 “高灵敏 + 高特异” 的双重优势：
1. 灵敏度：6 拷贝 / 反应，相当于 “大海捞针”
以猪肉检测为例（图 3B-D）：将猪肉 DNA 稀释至 1~4000 拷贝 / 反应，系统最低能检出 6 拷贝（9 次重复均阳性），比未优化前（160 拷贝）灵敏度提升 25 倍；鸭肉检测（图 5B-D）同样达到 6 拷贝的 LOD，证明系统稳定性强。
2. 特异性：只认目标肉，不 “认错”
检测猪肉时（图 3A），对牛、羊、鸡、鸭、鹅的 DNA 均无交叉反应；检测鸭肉时（图 5A），也不会与其他常见肉类混淆，避免 “误判”。
3. 实际样品：0.5% 掺假也能抓
作者用 “盲样 + 市售加工品” 验证实用性（图 3E-G、5E-G）：
• 盲样中即使只含 0.5% 猪肉 / 鸭肉 DNA，也能检出荧光信号；
• 市售香肠、牛肉丸等 5 种加工品中，4 种猪肉阳性、2 种鸭肉阳性，结果与实时 PCR 完全一致，证明可直接用于实际检测。

五、试剂 “神助攻”：
先达基因让技术落地更简单
1. 酶活性稳定，批次差异小
2. 实验重复性强。
3. 体系兼容性强，无需二次优化
4. 可直接适配 ERA 扩增体系
5. 适配 POCT 场景
6. 试剂支持冻干形式，常温运输储存方便
对于食品检测机构、疾控中心或生物企业来说，选择先达基因的试剂，能跳过 “试剂适配” 的坑，直接将技术优势转化为实际检测能力 —— 无论是肉品掺假筛查，还是致病菌、病毒检测，都能实现 “现场快检、精准判读”。
从肉品掺假到传染病筛查，单管检测正在打破 “实验室专属” 的壁垒。如果你也在开发核酸快检方案，不妨试试先达基因的试剂，让技术落地更高效、更稳定～