乳腺癌：HER2基因检测规范及进展

临床医师

目前，肿瘤靶向药物治疗飞速发展，寻找最适患者人群及准确的分子病理学诊断结果成为个体化及靶向治疗取得预期临床效果的重要保障。虽然，我国医疗机构的病理科建设已经取得了长足进步，但仍存在有待提高之处。本期邀请在分子病理学诊断方面具有成熟经验的病理学科专家，为读者解读有关肿瘤个体化治疗中，分子病理学检测需要注意的关键问题。

人表皮生长因子受体2（HER2）作为乳腺癌患者预后指标及曲妥珠单抗治疗的靶点，其检测重要性已经得到临床医生的广泛重视。尽管HER2的检测已有十余年历史，但仍然还存在一些问题。HER2检测准确性直接关系到临床治疗方案的制定，本文将首先介绍乳腺癌HER2检测的现状，再谈谈美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会（ASCO/CAP）2013年新发布的关于HER2检测指南的变化，以期为更准确地进行HER2检测及临床治疗提供帮助。

ASCO/CAP在2007年发布HER2检测指南后，我国也于2009年12月发布了新版指南，将HER2检测分为运用免疫组织化学染色（IHC）检测HER2蛋白表达水平和运用原位杂交检测HER2基因扩增状态两部分。

1、Her-2蛋白检测

一个准确的检测结果不仅受检测方法影响，同时受样本处理、所用试剂和结果判读三方面的影响，只有将这三方面同时做好，才能得到满意的结果。

标本处理

穿刺或切除后的乳腺癌组织应在1小时内固定，组织较大时应每隔5~10mm切开，用纱布或滤纸将相邻组织片分开，以确保固定液充分渗透和固定。固定液的量应为组织体积的10倍，固定时间以6~48小时为宜，此组织标本可以作为理想的免疫组织化学染色（IHC）、荧光原位杂交（FISH）和显色原位杂交法（CISH）检测和分析的对象，该过程的完成需要临床医生的积极配合。

结果判读标准

目前一些大医院使用全自动IHC仪器进行蛋白的检测，只要初始做好内外部质控，重复性也较好。结果判读的相应标准（按每张切片计算）如下：“0”为无着色；“l＋”为任何比例的浸润癌细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色；“2＋”为＞10％的浸润癌细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀的细胞膜棕黄着色或＜30％的浸润癌细胞呈现强且完整的细胞膜棕褐着色；“3＋”为＞30％的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕褐着色。


Her-2蛋白表达3＋者可作为临床医生建议患者接受曲妥珠单抗等药物治疗的依据；2＋者须进一步应用FISH或CISH等方法行HER2基因扩增状态检测（但仍可能出现结果不能确定的情况），或重复IHC进一步检测，也可选取不同组织块重新检测或送有质量保证的实验室进行检测。

总体来说，现在Her-2蛋白的检测相对较稳定，结果的重复性也较好。

ASCO/CAP2013指南中的新变化

指南中对于蛋白检测变化有两点：①样本固定时间从原来的6~48小时改为6~72小时，这样对于周五得到的标本，用足量的固定液固定，到周一取材也可以；②将Her-2蛋白3＋的判读标准从原来的“＞30％的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕褐着色”调整到“＞10％的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕褐着色”，这对于具有异质性的肿瘤样本判读很重要。

2、HER2基因的扩增检测

FISH检测

HER2基因扩增检测前对于样本的处理要求大致也同IHC检测，检测使用的方法主要是FISH。

FISH是常用的分子病理学技术，各单位方法可能稍有差别，目前进行HER2基因状态检测的探针绝大部分是同时含有HER2基因和该基因所在17号染色体着丝粒（CEP17）的混合探针。

指南对HER2基因检测的结果提出了总体要求：杂交后组织细胞中≥75％的细胞核呈现出双色信号，视为检测成功，且橘红色、绿信号互为对照，癌与非癌细胞互为对照。

FISH检测的结果判读

根据HE染色结果确认浸润性癌区域，再在FISH切片上寻找相同的组织细胞结构，观察是否存在HER2表达异质性，再通过特异单通道滤光片观察癌细胞核的FISH结果，并进行信号计数和比值计算。杂交信号计数应选择细胞核大小一致、胞核边界完整、荧光信号清晰的细胞，随机计数至少20个癌细胞核中的双色信号。

判读标准：①HER2/CEP17比值＜1.8提示无HER2基因扩增（图1），HER2/CEP17的比值＞2.2提示扩增（图2）；②若众多信号连接成簇时可不计算，视为基因扩增（图3）；③若比值位于1.8~2.2之间，须再计算20个细胞核中信号或更换分析人员重新计数，如果仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明或重复行FISH或IHC检测；④若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时，应在另一癌区域再计算20个以上癌细胞核中的橘红、绿色信号值，报告最大值并加以注释；⑤探针中加入CEP17是为在检测HER2基因同时检测17号染色体数目，部分乳腺癌存在17号染色体非整倍性，即非正常的二倍体，而是单体或多体（图4），这个内对照可将单纯HER2基因扩增和多倍体引起的HER2基因扩增分开，但有些病例虽然HER2基因扩增较弱（拷贝数＜4），但CEP17为单倍体，也会使得HER2/CEP17的比值＞2.2，这需要对这一判读标准进行修订。

ASCO/CAP2013指南中对于HER2基因检测新的变化

ASCO/CAP2013指南中新的判读标准如下：

HER2基因扩增单色探针检测，每个细胞平均HER2基因拷贝数≥6，提示扩增；HER2/CEP17双色探针检测，HER2/CEP17比值≥2.0，且平均HER2基因拷贝数≥4或＜4均提示扩增；HER2/CEP17＜2.0、且平均HER2基因拷贝数≥6同样也提示扩增。

HER2基因扩增不确定若单色探针检测，指平均HER2基因拷贝数≥4且＜6的病例；若双色探针检测，指HER2/CEP17比值＜2.0，且平均HER2基因拷贝数≥4且＜6的病例。

HER2基因不扩增若单色探针检测，指平均HER2基因拷贝数＜4的病例；若双色探针检测，指HER2/CEP17比值＜2.0，同时平均HER2基因拷贝数＜4的病例。

3、HER2基因的扩增检测

指南新标准解析

新标准是针对实际问题并结合临床试验结果而修订的。

FISH检测过程中可出现17号染色体多体，HER-2/CEP17比值＜2.2，但HER2拷贝数＞6，对这部分患者的治疗仍有一些争议，新的ASCO/CAP指南提示这些病例为HER2基因扩增。在检测过程中偶尔也可出现17号染色体单体，尽管HER2/CEP17比值＞2.2，但HER2拷贝数＜4，以往这部分患者在报告没有明确结论，新指南则认为这些病例同为HER2基因扩增。还有部分病例出现异质性，尽管ASCO/CAP2009年发布了HER2异质性的定义（5%~50%肿瘤细胞HER-2/CEP17＞2.2），新指南中指出，如果一张切片中＞10%的肿瘤细胞出现与其他区域不同的HER2基因扩增，须分别计数并报告。

尽管指南已有详细说明，但计数过程中仍有细节的问题，例如CEP17绿色点有大有小，是否都要计数，这可能对明显扩增或阴性的病例影响不大，但对HER2/CEP17比值不确定的病例就比较麻烦，须进一步积累经验，达成共识。

总之，HER2基因的分子检测，目前在蛋白水平检测相对成熟、稳定，但HER2基因检测还有一些问题需要进一步探讨。很高兴的是ASCO/CAP2013对相关问题作了详细说明，为我们今后分子检测工作的开展及临床治疗提供了理论依据。