细细扒一扒反转录，我们真的会做实验吗？

yunchu1991

细细扒一扒反转录，我们真的会做实验吗？

这周安排实验室的小姑娘测序一个LV病毒的一段。基本的步骤是先对病毒进行处理，释放病毒核酸，然后反转录，对cDNA进行PCR，最后对产物进行测序。

第二天就看到了小姑娘一脸愁容，原来是PCR跑胶结果显示没有目的条带。

“老师，我都是按照SOP一步步做的，很仔细，可是还是没有P出来。”小姑娘很委屈。

我深呼吸了一下，让自己恢复理智，这个项目客户催的紧，本身已经容不得一点差池。接手这个实验的小姑娘已经做了4年的QPCR及分子实验。但很明显，她没有达到我的预期。

我让她坐下，开始从她的实验思路开始复盘，寻找她的思维漏洞。对于研发人员来讲，解决单次实验问题并不是最主要的，优化思维方式才是最核心的。

我问：“这个实验跟你之前做的QPCR实验有何异同？”

小姑娘答：“之前的实验样本基本都是纯的RNA，这次是慢病毒，病毒的核酸是也是RNA，所以多了一步病毒前处理步骤，其他的反转录步骤都是一样的”

我继续问：“反转录的原理是什么呀？你说说看”

小姑娘答：“是指以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成一条与之互补的DNA链cDNA的过程”

我接着问：“不错，所以基于这一原理，你说说看，反转录反应过程需要哪些组分呢？”

小姑娘答：“逆转录酶、反转录的引物、dNTPs、buffer、水等”

我接着问：“那既然是以RNA为模板，反转录的引物和我们平时用的普通的扩增引物有什么不一样呢？”

小姑娘支支吾吾说不上来。

我接着问：“我们现在用的反转录试剂中的反转录引物你有看过吗？说明书里应该有。”

小姑娘红着脸说：“没仔细看过，因为从来也没失过手啊。”

我气笑了，让她直接把试剂说明书拿了过来，找到了引物类型，是Oligo(dT) 。我没有再追问了，她肯定也不知道Oligo(dT)适用的样本类型。于是直接开始给她授课了。

我指着说明书说道：“商业化的试剂盒通常将反转录组分预混成Master Mix，极大提高了操作的便捷性和结果的重复性。研究者只需加入模板RNA和引物即可。但是手上操作方便了不代表思考方面可以偷懒。目前我们可以用Oligo(dT)、随机六聚体、基因特异性引物（Gene-Specific Primer, GSP）作为反转录引物，但它们各有用途。

其中，Oligo(dT)由12-18个脱氧胸苷酸组成，通过与真核mRNA 3'末端的poly(A)尾特异性互补配对而结合。但是Oligo(dT)仅反转录带poly(A)尾的mRNA，对于原核生物无poly(A)尾的mRNA，它并不适用。

而随机六聚体是由4⁶ = 4096种可能的六碱基序列组成的混合物。它们可以随机结合在任何RNA链的任何位置。其通用性强可反转录所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA、 miRNA等。适用于任何物种。另外，对降解RNA兼容性好：即使RNA已断裂成片段，随机引物仍能结合并启动反转录，提供更稳健的结果。但其也有缺点，比如背景信号较高：会反转录所有RNA，包括不关心的rRNA，可能稀释目的cDNA的比例。

GSP则是一条根据目标RNA序列精心设计的反义DNA寡核苷酸引物（通常18-25 nt），能特异性地与目的RNA的特定区域互补结合。仅反转录目标RNA且反转效率最高。缺点是成本较高，每个靶基因都需要合成一条特异性引物。”

小姑娘听完点了点头。

我则继续输出：“接下来说说你实验的设计思路问题。首先，对一个新实验你并没有去把自己的盲点扫清，慢病毒里面是RNA，那它是哪种类型的RNA？序列是什么？目前的反转录体系是否适用于它的反转录这些你都没有提前去查，依赖自己的经验盲目往下做。”

小姑娘不好意思笑了笑说：“我知道该怎么办了。”

我追问：“怎么办？你说说，我听听”

小姑娘用笔在纸上开始画：“我刚刚听你说了原理，第一，我先去查下慢病毒的序列，比对下它合适的反转录引物；第二，对于病毒的前处理我觉得也可能是失败的原因，需要同步多试几种方法；第三，为了保险起见，我觉得也可以用常规感染细胞提取DNA的方法来安排后续测序。”

我欣慰的点了点头，脑子新就是转得快。

实验室的小姑娘是如此，恐怕大多数人都是如此。但是，工作的精进没有捷径，只有把问题的底层逻辑细细扒一扒，理解透了，才能做到真正的执行到位。