Western blot 实验的关键步骤？

HaHa · 发表于 2025-6-22 19:04

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作为经典的细胞生物学实验手段，哪些地方容易出问题欢迎补充，为小白指路。

原文地址：https://www.zhihu.com/question/570443537

继续前进 · 发表于 2025-6-22 19:04

在之前的分享中，小 M 为大家带来了“怎么做 Western blot? 看这一篇就够了！”和“WB 常见问题及解决方案”两篇推文。然而实际操作时，许多朋友发现仍会遇到各种各样的问题，本期小 M 跟您聊一聊 WB 的具体实操，以及每一个成功的 WB 实验背后容易被忽视，但却至关重要的小细节！

首先，我们来回顾下整个 WB 流程：蛋白样本制备 → 电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵育一抗 → 孵育二抗 → 显影 → 分析。

图 1. Western blot 的流程图[1]。

1 蛋白样本制备

1.1 总蛋白提取

(1) 准备溶液
室温融解蛋白裂解液 RIPA，加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物 (10X)，使最终浓度为 1X，混匀，立即放置在冰上。
(2) 不同样本
对于贴壁细胞： 4℃ 预冷的 PBS 洗 2~3 遍，用细胞刮子刮下细胞，或用胰蛋白酶处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
对于悬浮细胞：用 PBS 洗 2~3 遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
对于组织样品：剪取适量组织和适量混匀的蛋白裂解液于匀浆器中磨匀 (0.01 g 组织加上 50-100 μL 的蛋白裂解液)，直至看不见组织块；
(3) 裂解 细胞样品按 1×106 细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min (或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s)。组织样品转移匀浆液于 1.5 mL EP 管中，置于冰上裂解 15 min；
(4) 抽提 12,000 rpm, 4℃ 离心 10 min，立即吸取上清至一预冷的 1.5 mL EP 管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。

1.2. BCA 蛋白浓度测定

（1）制备好 BSA 标准品，并将 BCA 试剂 A 液: B 液=50:1 配制适量 BCA 工作液，样品用预冷 PBS 进行稀释；

（2）将标准品和样品分别加到 96 孔板中；
（3）各孔加入 BCA 工作液，37 ℃ 孵育 30 min；
（4）酶标仪 562 nm 波长读取各孔 OD 值；
（5）根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
<hr/>2 电泳

2.1 制胶（使用预制胶板请忽略此步骤）
(1) 准备玻璃板，确保两块玻璃板下缘水平且均无豁口，安装时内长外短，用手压实玻璃板及垂直槽制胶架。
(2) 倾斜垂直槽制胶架子装入垂直槽制胶固定架，注意为防止胶片变形漏液体，不要过分用力下压，并确保卡好。
(3) 按照每块 5 mL 配制分离胶 (1 mm 厚度)，轻轻混匀后立即铺板；(SDS-PAGE 凝胶配方详见“怎么做 Western blot? 看这一篇就够了！ ”)
(4) 铺板后用异丙醇将分离胶液面压平；
(5) 凝固 40 min 后，吸干异丙醇。用 ddH2O 轻轻冲洗并吸干；
(6) 按照每块 1.5 mL 配制浓缩胶，并插上合适大小的梳子，注意操作要迅速且水平，不能产生气泡； (8) 40 min 浓缩胶凝固后从制胶架上拆下，用 ddH2O 将残留在胶板上的胶清洗干净，并用保鲜膜包裹住，立即使用或 4°C 储存。
2.2 制样
加入4×上样缓冲液混匀，100℃ 放置 10 min，迅速冰浴冷却；
2.3 跑胶
（1）根据 BCA 测定结果，目的蛋白每孔上样量 20 μg-40 μg，内参蛋白每孔上样量 5 μg-10 μg；
（2）电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，80 V，约 30 min；
（3）溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，120 V，至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

3 转膜（湿转）

转膜步骤：
(1) 准备转膜缓冲液：
提前配制好转移缓冲液并预冷至 4 ℃；
(2) 准备 PVDF 膜和滤纸：
将 PVDF 膜在甲醇中浸泡 30 s (从不透明变为半透明)，接着用 ddH2O冲洗膜表面，最后将膜和滤纸放入转膜缓冲液中;
(3) 处理凝胶：
轻轻撬开玻璃板，切掉浓缩胶和周围不需要的区域。将凝胶放入转膜缓冲液中，确保胶的完整性;
(4) 制备转膜“三明治”：
三明治夹套的黑色面向下，透明面 (或红色面) 朝上打开放置在干净的桌面上。从下依次往上放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵。确保每一层之间都没有气泡，可以在放置最上层泡沫垫前使用滚轮轻轻滚动，以去除气泡;
(5) 转膜：
将夹套插入转移电泳芯中，确保黑色板朝向黑色板。然后将转移电泳芯放入转膜槽中，加入足够的转膜缓冲液，确保夹套完全浸没在缓冲液中。设置转膜电流为恒流，220 mA，根据蛋白大小不同设置转膜时间 (一般 30 kDa 以下转 30 min，30-70 kDa 转 60-90 min，70-150 kd 转 90-180 min);  (6) 转膜后处理： 转膜完成后，取出 PVDF 膜，用 TBST 冲洗膜表面，进行封闭等后续步骤。

4 封闭

室温下，将转好的膜于摇床上用 5% 的脱脂牛奶 (TBST 配制)，磷酸化蛋白检测用 5% 的 BSA (TBST 配制) 缓冲液，室温封闭 1-2 h。

封闭液的主要作用是占据非目标结合位点，降低背景信号，从而提高检测的特异性和灵敏度。常用的封闭液：脱脂奶粉、牛血清白蛋白 (BSA)。那么封闭液应该如何选择呢？

5 抗体孵育

(1) 孵育一抗：稀释一抗 (TBST 溶解的 5 % 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA)，4℃ 过夜孵育。
(2) 洗膜：按照 3 次 TBST 进行洗膜，每次 5 min。
(3) 孵育二抗：一般使用 TBST 溶解的 5% 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA 室温孵育 1-2 h。
(4) 洗膜：按照 3 次 TBST，1 次 TBS 进行洗膜，每次 10 min。

MCE 内参抗体特别推荐

5.1 内参抗体选择标准

内参在实验中扮演着至关重要的角色，想要挑选出靠谱的内参抗体？

你需要遵循以下三个法则：
5.1.1 样本来源与特性

1. 样本种属来源：哺乳动物样本可选择 GAPDH、β-Actin 等；植物样本则选择 Plant Actin、Rubisco 等；
对于研究较少的样本类型，可查阅相关文献以获取合适的内参蛋白推荐。例如：Shiyang Li 等人发现 gatB 基因是猪肺炎支原体最合适内参基因[4]。
2. 样本组织特性：不同组织细胞的结构和功能有所差异，应选择在该组织中稳定表达的蛋白作为内参。

5.1.2 目的蛋白定位

5.1.3 目的蛋白分子量

为了确保目的蛋白与内参蛋白能够清晰区分，所选内参蛋白的分子量应与目的蛋白相差至少 5 kDa 以上。（方便在同一张膜上同时孵育内参抗体与目的蛋白抗体，更精确地反映样本间的表达差异）
举例来说，当目的蛋白的分子量为 45 kDa 时，可以优先选择 GAPDH 或 β-Tubulin。GAPDH 的分子量约为 36 kDa，与 45 kDa 的目的蛋白相差足够大，可以清晰地区分开。

<hr/>Tips

需要注意的是，没有一种内参适用于所有组织和细胞，以下是小 M 为大家整理的一些特殊情况[5]。
1. 组织特异性内参选择

（1）脂肪组织：β-Actin 的表达量非常低，不适合作为内参。
（2）多组织多细胞样本对比：GAPDH 作为代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定，因此多组织多细胞样本对比时，建议选用 GAPDH 作内参[6]。β-Actin 和 β-Tubulin 等结构蛋白在不同组织中会有表达差异。
2. 修饰型蛋白检测时的内参选择

检测磷酸化、乙酰化等修饰型蛋白：β-actin 和 β-Tubulin 等结构蛋白表达相对稳定；
3. 疾病或处理条件下的内参选择

(1) 缺氧、糖尿病模型、肿瘤组织：GAPDH 表达增高，不适合作为内参[7]。(2) 抗癌和真菌药物处理：Tubulin 表达受影响，不适合作为内参。
4. 细胞功能或状态变化时的内参选择

（1）细胞增殖实验：c-Jun 自身表达会变化，不适合作为内参[8]。
（2）凋亡实验：TBP、Lamin 在凋亡过程中表达或定位会变化，不适合作为核内参。
5. 特殊组织类型的内参选择

骨骼肌、心肌、平滑肌：Tubulin 表达改变和特化，不适合作为内参。
6. 特殊样本类型的内参选择

血浆、乳汁、组织液等分泌样本：由于没有完整的细胞结构，可选择分泌型蛋白如 Transferrin 作内参。

6 ECL 显影

6.1 显影步骤：

(1) 在避光环境中，将 ECL 化学发光试剂 A 液、B 液 1:1 配置，充分混匀；
(2) 将 PVDF 膜置于化学发光成像仪载物台上;
(3) 用移液器吸取适量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上;
(4) 推入载物台，设置曝光时间进行图片采集 (可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。

WB 实验虽然看似简单，但其中蕴含的学问却不少。只有当我们真正掌握了每一个细节，并严格按照实验步骤进行操作时，才能获得准确、可靠的结果。希望今天的分享能够为大家在 WB 实验的道路上提供一些帮助~最后，小 M 衷心祝福使用 MCE 抗体产品的科学汪们: 高分文章发不停，基金中到数不清！

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