免疫组化（IHC）实验原理+实验步骤+注意事项！

非诚勿扰孟非

免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）全称为免疫组织化学，是一种广泛应用于生物医学研究及临床诊断的实验技术。其核心原理为利用免疫学中的抗原与抗体特异性结合，通过化学反应使标记抗体附带的显色剂发生显色。这种技术方法不仅能够定性识别组织和细胞内的抗原（通常是蛋白质），还可以精准定位这些抗原的细胞和组织分布，甚至进行相对定量的分析。
    通过免疫组化技术，研究者能够在病理形态学上观察到特定蛋白的存在与分布状态，这对于理解疾病的发病机制、开发新的诊断工具以及实施靶向治疗具有重要的科学价值。免疫组化为现代医学提供了锐利的诊断工具，并在人类健康领域展示了它的巨大潜力。

二、免疫组化实验步骤


1.烤片：将组织切片放置于65°C的烘箱中加热10-20分钟。此过程加速了脱蜡速率，提高了后续实验操作的效果。
2.脱蜡和复水：将组织切片放入染色架中，依次放入各个染色缸进行脱蜡和复水。由于蜡不溶于水，如果脱蜡不完全，切片上残留的蜡会导致染色不均匀、阳性结果不稳定、真假难辨、以及背景染色过强。使用梯度酒精以逐步去除二甲苯，切勿长时间在高浓度酒精中浸泡，以免导致组织细胞变形和影响显微镜下的组织形态。
3.脱蜡复水具体步骤如下:试剂：① 二甲苯 I → ② 二甲苯 II → ③ 无水乙醇 I → ④ 无水乙醇 II → ⑤ 95% 乙醇 → ⑥ 70% 乙醇⑦时间：每步5分钟。 接着，用摇床上的 PBS 洗涤3次，每次5分钟。
4.抗原修复:
①微波热修复法：将切片置于柠檬酸钠修复液中，放入微波炉中高火处理，间隔加热与冷却多次，以暴露抗原位点。
②热修复过夜,配制柠檬酸钠修复液至白盒,将切片放入染色架,染色架放入白盒中,盖紧盖子,置于65℃杂交炉中修复过夜(在处理高温加热时会从载片脱落的组织切片时,这种方法非常有效,特别是骨、软骨和皮肤)。
③大部分福尔马林固定的组织在免疫组化染色前需要进行抗原修复，以破坏固定过程中形成的亚甲基桥，从而暴露抗原位点供抗体结合。
④修复方法强度从高至低依次为高压修复、微波修复和胰酶修复。根据不同的组织、抗原和抗体情况，选择合适的修复方法和修复液。

5.冷却和洗涤：将染色架置于装有凉水的容器中，冷却至室温。在摇床上用 PBS 洗涤3次，每次5分钟。
6.阻断内源性过氧化物酶：使用蜡笔圈画出组织周边，限制区域后，滴加20μL 3% H₂O₂于组织上，室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
7.洗涤：在摇床上用 PBS 洗涤3次，每次5分钟。
8.封闭：使用3% BSA或3% FBS作为封闭液（与二抗来源相同）。在组织上滴加20μL封闭液，室温下封闭0.5-2小时后甩掉，但不洗，以减少非特异性蛋白结合。
9.一抗孵育：用 PBS 按1:50至1:200比例稀释一抗，滴加20μL稀释液于组织上。阴性对照使用稀释液替代一抗，4°C孵育过夜。孵育后摇床上用PBS洗涤3次，每次5分钟。
10.二抗孵育：滴加20μL二抗于组织上，室温孵育1-2小时。孵育结束后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
11.DAB显色:按照20:1的比例用DAB稀释液稀释DAB。在组织上滴加20ul稀释的DAB,避光显色3-10min(DAB试剂有多种,也有A液和B液等量混合后直接使用)。显微镜下观察染色程度,适时终止反应。ddH₂0洗涤3次,每次5 min。注意:背景深浅和特异性染色深浅均可由DAB孵育条件决定。DAB显色时间主要由显微镜下控制显色时间,到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗;DAB显色时间很短(小于1min)就出现很深的棕褐色,这很可能说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长;若短时间就出现深背景,可能前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;DAB显色时间很长(超过10min)才出现阳性染色,可能说明抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4度过夜);另外就是封闭时间过长。
12.苏木素复染：将切片置于苏木素中染色2-10分钟，洗涤以显现细胞核的蓝色增强蛋白定位效果。
13.分化:切片置于分化液分化1-2s(分化时间需要自己摸索),ddHO洗涤10次,每次30s。
14.返蓝:切片置于0.1%氨水返蓝2min左右(返蓝时间需要自己摸索),ddH₂O洗涤10次,每次30s。
15.梯度脱水:75%乙醇5min,95%乙醇5min,无水乙醇5min×2次(梯度酒精的作用:脱水,以便片子长期保存)
16.透明：二甲苯处理使切片透明，利于观察。
17.封片：使用中性树胶封片，避免气泡产生。封好的切片在超净台中晾置以备显微镜下观察。

三、相关试剂配方


①柠檬酸溶液（50 mL）：称取1.05克柠檬酸，并用去离子水（ddH₂O）定容至50毫升。该溶液可在室温下保存，适合长期使用。
②柠檬酸三钠溶液（250 mL）：称取7.35克柠檬酸三钠，用ddH₂O定容至250毫升。该溶液应在室温下保存，并适合长期使用。
③抗原修复液（250 mL）：配制时，在250毫升的总溶液中混合4.5毫升柠檬酸溶液和20.5毫升柠檬酸三钠溶液，用1× PBS 定容至250毫升。该溶液应现配现用以确保其有效性。
④分化液（500 mL）：将495毫升75%乙醇与5毫升浓盐酸混合均匀后，室温保存。该溶液可以重复多次使用，符合节约与安全的标准。
⑤返蓝液（1%氨水，500 mL）：将0.5毫升氨水与499.5毫升ddH₂O充分混合。此返蓝液应保存在室温条件下，并可多次使用以节约资源。
⑥封闭液（3% BSA或3% FBS，1 mL）：混合0.03克BSA或30微升FBS与1毫升PBS。封闭液为现配现用，确保稀释均匀以提供最佳封闭效果。
⑦10× PBS（1 L）：依次将80克氯化钠（NaCl）、2克氯化钾（KCl）、14.4克磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和2.4克磷酸二氢钾（KH₂PO₄）溶于1000毫升ddH₂O，常温保存，作为储备液。
⑧1× PBS（1 L）：取100毫升10× PBS，并用ddH₂O定容至1000毫升制备成工作浓度的PBS溶液。

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