免疫荧光染色太强是怎么回事？？？

John

一、实验操作因素
1.        抗体浓度过高或孵育时间过长
抗体浓度过高会加剧非特异性结合，导致荧光信号过强；孵育时间过长或温度过高也会增加背景染色。
2.        封闭不充分
封闭步骤用于减少非特异性结合，若封闭液选择不当或孵育时间不足，会导致背景增强。
3.        洗涤不彻底
各步骤间洗涤不充分（如缓冲液用量不足、时间过短）会残留未结合的抗体或试剂，增加非特异性信号。
二、试剂与样本问题
1.        二抗非特异性结合
二抗可能与样本中其他成分发生非特异性结合。可通过设置空白对照（仅加二抗）验证，若出现染色则需更换二抗。
2.        自体荧光干扰
组织自身可能因戊二醛固定产生醛基残留，或存在内源性荧光物质（如脂褐素）。建议用含0.1%氢氧化钠的PBS洗涤，或使用苏丹黑/硫酸铜漂白。
3.        荧光素标记过量或纯度不足
抗体标记的荧光素分子过多或含有杂质，会导致非特异性吸附。
三、样本处理不当
1.        组织切片过厚
切片过厚可能导致荧光信号重叠或背景增强，建议适当调整切片厚度。
2.        组织干燥或固定不当
染色过程中组织干燥会引发非特异性结合；戊二醛等固定剂使用不当可能增加自体荧光。
四、其他潜在原因
1.        信号放大过度
若使用信号放大技术（如TSA），可能导致信号过强，需优化试剂浓度或反应时间。
2.        仪器参数设置不当
荧光显微镜的曝光时间或光源强度过高可能使信号过曝，需调整至合适参数。
建议解决方案
优化抗体浓度及孵育时间（梯度测试）
延长封闭时间或更换封闭液（如使用BSA或血清）
增加洗涤次数及时间（推荐3次，每次5分钟）
设置空白对照排除二抗干扰
选择高纯度、低交叉反应的二抗（如Alexa Fluor系列）

原文地址：https://www.zhihu.com/question/1897586169279132505

大力水手

免疫荧光染色结果太强，是操作失误还是另有原因？
免疫荧光染色是一种常用的生物学技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。如果染色结果过强，可能有几个原因。首先，抗体浓度过高或孵育时间过长会加剧非特异性结合，导致荧光信号过强。其次，封闭不充分或洗涤不彻底也可能导致背景染色增强。此外，试剂污染、环境因素以及细胞内自发荧光等也可能影响染色结果。为了避免这种情况，可以优化抗体浓度及孵育时间，确保封闭充分，加强洗涤步骤，并保持实验环境的清洁。同时，对于自发荧光较高的细胞，可以选择合适的激发波长和检测通道，以减少自发荧光的干扰。
注：仅供参考，具体实验原理及步骤说明请咨询相关产品供应商和技术老师！

检验医师

你他喵的，什么鬼，你太看得起知友了