一篇文章，手把手教你学会ELISA实验

生物科研实验室

一、实验原理（以双抗体夹心法为例）双抗体夹心法ELISA的核心是“抗体-抗原-抗体”三明治结构：1.包被抗体：固定在酶标板底部，捕获样本中的目标抗原；2.检测抗体：携带辣根过氧化物酶（HRP），与抗原另一表位结合；3.显色反应：HRP催化TMB底物由无色变蓝色（加入终止液后转黄色），吸光度与抗原量成正比。二、实验准备1.酶标板：•高结合力板（如Corning Costar 9018）适合低丰度蛋白（IL-6等细胞因子）；•中结合力板（如Nunc MaxiSorp）用于高浓度蛋白（血清抗体）。2.关键试剂：•包被液：0.05M碳酸盐缓冲液（pH 9.6）：Na₂CO₃ 1.59g + NaHCO₃ 2.93g + 蒸馏水1L；•封闭液：5%脱脂牛奶/PBS（现配现用）或1% BSA/PBS（避免磷酸化干扰）；•洗涤液：PBST（0.05% Tween-20的PBS），4℃保存；•TMB显色液：避光保存，出现淡蓝色即失效。三、操作流程第一步：抗体包被 用包被液稀释捕获抗体（1-10μg/ml），每孔加100μl，保鲜膜封板，4℃过夜（16小时）。关键细节：包被后勿甩板！倾斜酶标板倒出液体，在滤纸上轻拍3次。
一、实验原理（以双抗体夹心法为例）双抗体夹心法ELISA的核心是“抗体-抗原-抗体”三明治结构：1.包被抗体：固定在酶标板底部，捕获样本中的目标抗原；2.检测抗体：携带辣根过氧化物酶（HRP），与抗原另一表位结合；3.显色反应：HRP催化TMB底物由无色变蓝色（加入终止液后转黄色），吸光度与抗原量成正比。二、实验准备1.酶标板：•高结合力板（如Corning Costar 9018）适合低丰度蛋白（IL-6等细胞因子）；•中结合力板（如Nunc MaxiSorp）用于高浓度蛋白（血清抗体）。2.关键试剂：•包被液：0.05M碳酸盐缓冲液（pH 9.6）：Na₂CO₃ 1.59g + NaHCO₃ 2.93g + 蒸馏水1L；•封闭液：5%脱脂牛奶/PBS（现配现用）或1% BSA/PBS（避免磷酸化干扰）；•洗涤液：PBST（0.05% Tween-20的PBS），4℃保存；•TMB显色液：避光保存，出现淡蓝色即失效。三、操作流程第一步：抗体包被 用包被液稀释捕获抗体（1-10μg/ml），每孔加100μl，保鲜膜封板，4℃过夜（16小时）。关键细节：包被后勿甩板！倾斜酶标板倒出液体，在滤纸上轻拍3次。
第二步：封闭非特异位点  每孔加200μl封闭液，37℃孵育2小时。注意封闭液必须完全覆盖孔底，避免边缘干涸导至背景不均。 第三步：样本处理与加样 1.血清样本：1:10稀释于样本稀释液（含1% BSA的PBST）； 2.细胞上清：4℃ 300g离心10分钟去除碎片； 3.标准品：用稀释液梯度稀释（如1000→500→250→... pg/ml），每孔100μl； 4.加样顺序：从低浓度到高浓度，每样本设3复孔。
第四步：抗原抗体结合  37℃孵育90分钟，倒掉液体后进入洗板程序。致命陷阱：孵育超时导至非特异结合增加。 第五步：洗板
1.自动洗板机程序：注满PBST→静置30秒→吸净，重复3次；
2.手动洗板：多道移液器注满PBST→倾斜倒液→拍板3次（垂直拍击滤纸），重复5次。警告：拍板力度过大导至包被抗体脱落！
第六步：检测抗体孵育  用抗体稀释液配制HRP标记检测抗体（浓度参考说明书），每孔100μl，37℃孵育60分钟。 技巧：二抗稀释后离心（12000g，1分钟）去除沉淀。 第七步：洗板×5次
同第五步，增加至5次洗涤（高背景样本可延长至7次）。 第八步：TMB显色  每孔加100μl TMB显色液，室温避光反应15分钟（或阳性孔微蓝时终止）。 技巧：将板置于白色背景上观察孔底颜色均一性。 第九步：终止与读板  每孔加50μl 2M H₂SO₄（蓝色→黄色），立即用酶标仪检测450nm吸光度（参比波长630nm）。 注意：终止后30分钟内完成检测！
四、数据分析
1.标准曲线拟合： •以标准品浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标； •选择四参数逻辑回归（4PL）拟合（R²＞0.99），避免线性拟合误差。
2.样本浓度计算： •根据拟合方程Y=(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，反推样本浓度； •复孔CV值＞15%的数据剔除。