Caco-2微流控芯片模型预测药物的肠道吸收.2024

风云

Validation of a Caco-2 microfluidic Chip model for predicting intestinal absorption of BCS Class I-IV drugs

该论文的独特性在于首次全面验证了一种商业化的微流控芯片（Gut-on-a-Chip）模型，用于预测不同生物药物分类系统（BCS）类别药物的肠道吸收，填补了当前缺乏有效的透过性评估工具的空白。其创新性体现在使用19种BCS Class I-IV化合物，对比评估了微流控芯片与传统Caco-2 Transwell模型的透过性差异，提供了重要的体外-体内相关性（IVIVC）数据，尤其是在这方面的预测准确性（r² = 0.59-0.83）。然而，该研究也存在一定局限性，如只针对19种化合物进行验证，样本量较小，可能影响结果的普适性。此外，对于某些特定药物的生物利用度，微流控芯片模型的预测能力还有待进一步验证。


主要关键词：  

• 1. Caco-2
  
• 2. Microfluidic Chip
  
• 3. Intestinal Absorption
  
• 4. Biopharmaceutics Classification System (BCS)
  
• 5. In Vitro In Vivo Correlation (IVIVC)
  

口服给药被认为是患者最喜欢的给药途径，然而，药物必须具有足够的可溶性和渗透性，才能成功配制口服制剂。在开发更具预测性的溶解度和溶解工具方面取得了进展，但为渗透率测定开发的工具尚未像金标准Caco-2 Transwell测定法那样得到广泛验证。在这里，我们使用19种代表性的生物制药分类系统（BCS）I-IV类化合物在Transwells和市售微流控芯片中评估了Caco-2肠道通透性测定。对于每种选定的化合物，我们进行了全面的存活率测试，量化了其表观渗透性（Papp），并建立了在两种培养条件下人体吸收分数（fa）的体外体内相关性（IVIVC）。安替比林（Transwell Papp:38.5±6.1×10-8 cm/s vs Chip Papp:32.9±11.3×10-8 cm-s）和纳多洛尔（Transwell Papp:0.6±0.1×10-7 cm/s vs Chip Papp:3±1.2×10-7 cm-s）证明了模型之间的渗透性差异。Transwell模型的体外-体内相关性（IVIVC；Papp与fa）（r2=0.59-0.83）与Chip模型（r2=0.41-0.79）相似，突出了相似的预测水平。与历史数据相比，我们的Chip-Papp数据与Ussing室中评估的天然组织更为接近。这是第一项全面验证商业芯片肠道模型作为评估口服吸收的预测工具的研究，以进一步减少我们对动物模型的依赖。
1 介绍

口服给药是最常见的、患者首选的给药途径（Alqahtani，2021，Sastry等人，2000，Hua，2020）。成功的口服制剂需要活性药物成分（API）在胃肠道中充分溶解和渗透。生物制药分类系统（BCS）将API分为高/低渗透性和高/低溶解度（FDA，2021，Amidon，1995）。如果API在37°C下在1.2–6.8的pH范围内完全溶于250 mL或更少的水性介质中，则其溶解度被归类为高度可溶（FDA，2021，Amidon，1995）。预测API溶解度的模型得到了一致的改进，如生物相关缓冲液（Otsuka et al.，2013，Dressman，1998，Hörter和Dressmann，2001，Fuchs，2015，Shono，2009，Moreno，2006）、多室溶出装置（Carino et al.，2010，Carino et al.，2006，Takeuchi，2014，Matsui，2016，Tsume，2017）和基于计算机生理学的药代动力学（PBPK）模型（Sjögren et al.，2016，Sjögren，2013，Yuvaneshwari，2022）。API的渗透性可以基于来自人类药代动力学研究的吸收程度或使用各种体内动物模型或体外方法来确定。目前，根据美国食品药品监督管理局的指导方针，唯一批准的体外方法是人结肠癌细胞（Caco-2）Transwell单层模型（美国食品药品管理局，2021年，Hidalgo等人，1989年）。这仍然是药物发现和开发中确定表观渗透率（Papp）的金标准。
体外肠通透性模型需要三个关键要素：（1）上皮层，（2）顶端基底外侧隔室，（3）多孔膜。Caco-2 Transwell系统（图1A）因其与人体空肠有效通透性的相关性（Artursson和Karlsson，1991年，Artursson等人，2001年）、与人体吸收分数（fa）的相关性（Lennernaäs，1998年，Lennernäs，2007年，Lenneräs，1997年）及其可重复性（Balimane，2004年，Marino，2005年，Markowska，2001）而得到证实。然而，该模型缺乏人类肠道环境的复杂性，这降低了预测的准确性。《食品、药物和管理局（FDA）现代化法案2.0》和国家研究动物替代、改良和减少中心（NC3Rs）重申了对更好、更具预测性的体外模型的需求（Han，2023，Prescott和Lidster，2017，Clark，2018）。复杂的体外模型（CIVM）已被研究用于引入仿生组织，如三维类器官（Hofer和Lutolf，2021）、球体、生物打印组织（Murphy和Atala，2014）和微流控芯片系统。在这些系统中，微流控芯片系统（图1B）创建了受控的微环境，并建立了生理剪切条件，增强了与体内系统类似的结构和功能能力（Kim，2012，Kim和Ingber，2013，Kasendra，2020，Kasendra2018）。CIVM还可以减少对动物渗透性研究的依赖，简化发现和开发过程。为了在药物开发中适当使用CIVM，需要使用模型化合物进行验证，以确保模型的准确性和可重复性。
在这项研究中，我们在两个临床前模型中评估了Caco-2肠通透性测定：传统的静态2D Transwell和市售的微流体3D芯片。我们选择了17种具有代表性的BCS类药物和两种荧光渗透性标记，这些标记基于“基于生物制药行业分类系统指南的立即释放固体口服剂型的体内生物利用度和生物等效性豁免研究”中的FDA验证组，涵盖了高、中、低和零渗透性范围。我们测定了两个模型系统中每种化合物的Papp，随后建立了它们与人体吸收分数（fa）的相关性。这是对其肠道芯片模型的首次验证研究，这些结果建立了一种可靠的工具，可以提供预测药物吸收，从而更好地将药物从工作台翻译到床边。
2.材料和方法

2.1. 材料

API从表S1和表S2中列出的各种来源获得。芯片、Pod、ER-1和ER-2表面活化试剂购自Emulate Bio。除非另有说明，否则所有其他材料均购自赛默飞世尔科技公司。Caco-2细胞（HTB-37）购自美国典型培养物保藏中心。
2.2. 细胞培养

Caco-2细胞系是根据既定的FDA渗透性评估标准（FDA，2021）选择的。Caco-2（HTB-37）（第7-30代）在Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM，Fisher Scientific）中培养，该培养基补充了10%（v/v）胎牛血清（FBS，Gibco）和1%（v/v）青霉素-链霉素（pen strep）。Caco-2每2-3天喂食一次补充的培养基，并在37℃、5%二氧化碳（CO2）和80%湿度的环境中浸泡以维持。
2.3. Transwell模型

对于静态Transwell，Caco-2以1×105个细胞/mL的速度接种在0.33 cm2 Transwell（100µL）中，Transwell含有直径6.5 mm、孔径0.4µm的聚碳酸酯膜，没有细胞外基质涂层（ECM）。每2-3天定期给细胞喂食21天。使用带有筷子电极的Millicell ERS伏特计（Millipore Sigma）测量单层跨上皮电阻（TEER，Ω.cm2）。在运输研究前后进行TEER测量，以确认屏障的完整性。
2.4 芯片模型

芯片系统（Emulate Bio，Inc）由三层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流体装置组成：（1）顶层：1000µm宽×1000µm高，（2）多孔PDMS膜：7µm孔径；间距40μm；50µm厚，（3）基底外侧层：1000µm宽×200µm高。按照制造商的方案，将ER-1溶解在ER-2中，并将溶液移入芯片的顶端和基底外侧通道。然后将芯片暴露于紫外线下15分钟。取出溶液并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，然后在DMEM中用Matrigel（100μg/mL；Corning）涂覆顶端和基底外侧通道。芯片在37℃下涂覆至少1小时，或在室温下涂覆过夜。移除基质胶溶液，以1×107个细胞/mL的密度将细胞接种到仅40μL的顶端通道中。通过Steriflip过滤器单元（Millipore Sigma）对补充的DMEM介质进行脱气，以尽量减少芯片通道中气泡的形成。将DMEM移入基底外侧通道。在培养箱中接种过夜并确认细胞粘附后，以30µL/hr（流体剪切应力：0.02达因/cm2）的速度用脱气补充培养基连续灌注芯片7天。第8天，根据第2.9节，用FITC葡聚糖3 kDa（FD3）评估基线渗透性测量值，以确定阈值<5×10-7cm的细胞屏障完整性/


2.5. 小分子的选择和样品制备

根据《生物制药行业分类系统指南》（美国食品药品监督管理局，《基于M9生物制药分类系统的生物豁免》，2021年），从立即释放固体口服剂型的体内生物利用度和生物等效性豁免研究中选择了一系列小分子。表1显示了所有化合物及其各自的BCS类别、FDA验证组、logP和人体吸收分数（fa）。所有化合物的储备溶液在 transport buffer（TB）中以0.5-1 mg/mL的浓度制备，其中含有Hank&#39;s平衡盐溶液（HBSS）、25 mM HEPES和12.5 mM葡萄糖溶液（Gibco）。不直接溶于 transport buffer (TB）的化合物首先以100 mg/mL的初始浓度溶解在二甲亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich）中，然后稀释100倍于 transport buffer，包括：酮洛芬、萘普生、美托洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、呋塞米、纳洛尔、阿昔洛韦、法莫替丁。如第2.6节所述，由于化合物的溶解性或细胞活力，除普萘洛尔（约0.1 mg/mL）、纳多洛尔（约0.5 mg/mL）和阿昔洛韦（约0.7 mg/mL）外，所有转运研究均在约1 mg/mL浓度的API下进行。表S1和表S2列出了所有化合物的供应商，表S4列出了加药浓度。
2.6. 细胞活力测定

为了确定适当的API浓度，使用比色法Promega CellTiter 96®（MTS）活力测试（Promega）。在透明的96孔板中，以2×104个细胞/mL接种Caco-2细胞，并在Transwell或芯片运输测试前生长2-3天。移除培养基后，将细胞与在TB中稀释的0.1、1和10 mg/mL三种浓度的API一起孵育。奥洛尔、阿替洛尔、速尿、纳多洛尔、阿昔洛韦和法莫替丁在10 mg/mL的TB中不溶，不包括在测定中。阴性（FD3和未治疗）和阳性（0.1%（v/v）Triton-X）对照用于验证测定结果。在37◦ C培养箱，在5%CO2下，取出API溶液，用PBS冲洗细胞，并在培养箱中与Promega CellTiter 96®水性单溶液细胞增殖溶液一起培养1-4小时。使用荧光分光光度计（Spectramax Gemini，Molecular Devices）在490nm处测量吸光度。根据结果，我们选择了不诱导细胞毒性的最高浓度进行以下实验。
2.7. 免疫细胞化学与图像处理

Transwell和Chip用FIX&PERM™细胞渗透试剂盒（Invitrogen）固定和渗透。样品首先在室温下用4%多聚甲醛（PFA）或试剂盒（Invitrogen）中的培养基A固定15分钟，然后在1X PBS中洗涤。对于芯片样品，采用ScaleS（含山梨醇的SCALE）配方，以提供稳定的组织保存和提高的透明度（Ondatje，2022；Hama，2015）。芯片样品与SCALE S0一起孵育20分钟三次，在SCALE A2中清除40分钟两次，在CALE B4中清除30分钟，在SCARE A2中清除20分钟三倍，在PBS中漂洗10分钟两次。随后，Transwell和Chip样品均用10%正常驴血清封闭30分钟，并用1X PBS洗涤三次。样品与1:100的结合门控抗体（ZO-1和E-cadherin）在培养基B（Invitrogen）中在4℃下孵育过夜。核染色DAPI在室温下孵育1小时。Transwell样品用1X PBS洗涤三次，用一次性手术刀仔细提取，并用Prolong Diamond防磨试剂（Invitrogen）安装在载玻片上。芯片样品用S4进行三次20分钟的最终清除，然后将样品储存在4℃的SCALE S4中，直到准备成像。使用Biotek Lionheart FX荧光显微镜（安捷伦）对所有样本进行成像，并使用FIJI ImageJ（国家卫生研究所）进行图像分析。
2.8. Transwell转运分析

我们评估了所选小分子和荧光标记物在Transwells培养的Caco-2单层上的顶端到基底外侧转运（Hubatsch等人，2007）。生长21天后，洗涤Caco-2细胞，并在37℃的砧板中用TB平衡1小时。在时间0处将感兴趣的通量分子添加到顶端侧。在0和120分钟时从心尖腔采集样本（100µL），在0、30、60、90和120分钟从基底外侧腔采集样本。在基底外侧腔中用新鲜TB补充等效体积。在试验过程中，Transwells在37℃、80 rpm的轨道振荡器上孵育，以减少未搅拌水层的影响。样品API浓度通过超高压液相色谱法（UPLC）或液相色谱-质谱法（LC-MS）分析方法测定，荧光标记物通过荧光光谱仪（Spectramax Gemini，Molecular Devices）定量。表观渗透率（Papp）根据以下方程式计算：


其中dQ/dt是穿过上皮的运输速率，A是表面积（0.33cm2），C0是顶端侧通量分子的起始浓度。使用体积计在0和120分钟时测量TEER，以确保单层完整性。基本TEER值要求大于300Ωcm2。
2.9. 芯片传输分析

我们评估了所选小分子和荧光标记物在微流控芯片中培养的Caco-2上皮细胞上从顶端到基底外侧的转运。以125µL/h的速度在顶端和基底外侧入口介质储器中用TB平衡通道30分钟。芯片中顶端通道的入口在时间0时被感兴趣的通量分子替换。在2和4小时时从心尖出口和基底外侧出口通道取样。通过UPLC或LC-MS分析方法测定API样品浓度，并通过荧光光谱仪测量对荧光标记物进行定量，以计算Papp。Chip Papp根据以下方程式计算：


其中QA和QB分别是顶端通道和基底外侧通道中的流体流速（cm3/s），SA是通道的表面积（0.17cm2），CA和CB分别是顶端和基底外侧渠道中的浓度。
2.10. 通量分子定量

在激发波长为490nm、发射波长为525nm的荧光分光光度计（Spectramax Gemini，Molecular Devices）中测量FD3和路西法黄（LY）样品。使用Acquity二元UPLC（Waters Corporation）分离高渗透性API（表S1），其中PDA检测连接到C18柱（Acquity UPLC BEH 1.7μm，2.1×100mm，Waters Corporation）。流动相分别为0.1%（v/v）三氟乙酸水溶液（流动相A）和0.1%（v/v）三氟醋酸乙腈溶液（流动相和B）。样品以5μL的浓度注入，并在设置后3分钟内使用线性梯度增加%B进行方法开发（表S1）。通过紫外光谱吸光度（210-400nm，分辨率1.2nm）进行检测，并使用最大波长（λmax）进行定量（表S1）。使用连接到反相Acquity C18柱（UPLC BEH 1.7μm，2.1×100mm）的Acquity Binary Waters UPLC分离中低渗透性API（表S2）。使用Q-Exactive Plus或Orbitrap Fusion LUMOS质谱仪（ThermoFisher）通过高分辨率质谱法进行检测。除呋塞米外，表S2中的所有化合物均使用以下流动相。流动相A和B分别由0.1%（v/v）甲酸水溶液和0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液组成。对于呋塞米，流动相A和B分别由20mM乙酸铵的水溶液和乙腈溶液组成。所有样品均以5μL的注射体积注射，并按照表S2中的设置，在3分钟内以增加B%的线性梯度进行方法开发。对于每种MS方法，为每种化合物的质量选择了H-ESI源的靶向单离子监测（SIM）模式，隔离窗口为±4 m/z。峰值积分参数列于补充信息中。
2.11. 数据分析

所有数据分析均在GraphPad Prism 9®中进行。所有数据均以平均值±平均值标准误差（SEM）表示。针对Papp值与吸收分数之间的相关性，采用半对数拟合线进行了非线性回归。
3.结果

3.1. 小分子浓度的优化

为了防止在Caco-2单层上孵育2小时期间诱导细胞毒性，我们评估了不同浓度（0.1、1和10mg/mL）的17种API处理的细胞存活率。由于不溶于TB，存活率测定中省略了酮洛芬、萘普生、美托洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、呋塞米、纳多洛尔、阿昔洛韦和法莫替丁的10mg/mL。将细胞以2×104个细胞/mL的密度接种在常规96孔板中进行测定（掐指一算，一孔100ul，就是2000个细胞。）。使用比色MTS测定法，根据相对于未处理对照的百分比（%）对存活率进行定量（图S1）。我们根据阳性对照（0.1%（v/v）Triton X）评估了结果的有效性，其存活率为24.5%，而阴性对照（未处理和FD3）的存活率接近100%。这些数据表明，较高浓度的普萘洛尔前体（1mg/mL）、氯苯那敏（10mg/mL）、依那普利（10mg/mL。对于转运测定，我们选择的API浓度范围为0.1−1 mg/mL，取决于细胞活力和API在TB中的溶解度，以确定Transwells和Chips的表观渗透率。
3.2. 两种模型中肠细胞的形态学

在API转运研究后，实施ZO-1和E-钙粘蛋白的免疫细胞化学以观察细胞屏障。在Transwell中，肠细胞显示出紧密连接和粘附连接的鹅卵石状外观，表明单层保存良好（图2A）。相比之下，高浓度普萘洛尔（1 mg/mL）导致屏障功能丧失，如图2B所示。这一观察结果与TEER的显著降低相关（图S2）。在存在非细胞毒性浓度的API（例如0.1 mg/mL普萘洛尔）的情况下，细胞保持其基本条件，呈现平坦的鹅卵石/铁丝网外观（图2C）。
当最初在芯片中用ZO-1和E-cadherin染色时，信号有限（图S3）。在使用广泛的SCALE方法清理通道后（Ondatje，2022；Hama，2015），清晰度和可见度得到了提高，从而能够进行成像和分析。在连续流动条件下，Caco-2细胞在7天后形成绒毛状结构（图3）。三维投影（图3B）显示，细胞高度和表面积增加，与之前关于相同和类似系统的报告一致（Kim，2012；Kim和Ingber，2013；Kulthong，2020）。这突显了流体剪切应力在概括体内肠道环境中的重要性。


3.3. 静态Transwell和动态芯片下Caco-2渗透率的比较

在Transwell系统和微流控芯片系统中测定了所有19种API（17种API和2种荧光标记）的渗透性。我们选择了分为高、中、低和零渗透性的API来建立线性关系。首先测定了Transwell插入物上培养的Caco-2单层的表观渗透率（Papp）（图4A）。我们发现，高渗透性API（fa≥85%）的Papp比低渗透性API高近两个数量级（fa<85%）。高渗透性API的Papp范围为2.3至4.3×10-5cm/s，而中低渗透性API范围为5.9至28.9×10-8cm/s，氯苯那敏除外（3.7×10-5cm-s）。当比较低（fa<50%）和中等（fa=50-84%）时，结果在相同的数量级内。在API治疗前和治疗后，在整个实验中监测TEER的屏障完整性。根据图4B，相对于治疗前时间点对TEER进行了量化。标准化的TEER数据与之前的MTS数据相结合，表明Caco-2单层在运输分析期间没有受到API孵育的显著影响。此外，我们使用两种惰性荧光细胞旁标记物LY（分子量=444 Da）和FD3（分子量=3 kDa）验证了这些结果。这些标记表明，分子大小有限的Papp与既定数据一致：FD3-Papp为7.9×10-8cm/s<LY-Papp为49.9×10-8cm/s。
无法测量芯片中Caco-2上皮的TEER，以确定是否可以将其纳入或排除在运输研究之外。因此，在连续流动7天后，我们评估了FD3的渗透性（在TB中为0.1mg/mL，持续4小时）。该测量作为质量控制，以确定渗透率是否在阈值<5×10-7cm/s范围内，并确认屏障的完整性。在用FD3确认棒的完整性后，将17种API溶液以125µL/小时灌注通过芯片。图5中报告了芯片Papp结果。当比较Chips中的高渗透性化合物和低渗透性API时，√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√√范围差异小于40倍（安替比林与那多洛尔）。这是一个比Transwell条件更严格的范围，Transwell条件的差异超过500倍（安替比林与纳多洛尔）。对于Transwells和Chip渗透性研究，我们比较了各自培养模型中的API，如安替比林[高]（Transwells：3853.05×10-8cm/s vs Chip:3294.82×10-8cm/s）、依那普利[中等]（Transwell：10.18×10-8cm/h vs Chip:118.42×10-8cm/s）和依那普利（低）（Transwells:5.87×10-8cM/s vs Chip:73.76×10-8cb/s）。我们使用LY和FD3作为基于尺寸的渗透率标记进一步验证了这些结果。这些标记物遵循与Transwells和文献报道相同的趋势：FD3-Papp为24.1×10-8cm/s<LY-Papp为138.8×10-8cm/s。渗透性的差异表明流体剪切应力是影响人类肠上皮细胞药物吸收的关键特性之一，并可能改变人类口服药物吸收与Caco-2细胞Papp的相关性。
3.4. Caco-2通透性与人体肠道吸收的比较

图6A中绘制了Transwells（圆形）和Chips（方形）中小分子的人体吸收分数（fa；从已发表的临床数据中获得）和实验Papp。依那普利、依那普利拉、法莫替丁、赖诺普利和特布他林没有临床fa。将化学结构（摩尔文件）导入GastroPlus 9，并将预测的fa用于这些化合物。根据结果，Transwells的数据分布比Chips更宽，这意味着范围为0.04×10-6cm/s至43.5×10-6cm-s，而Chips的分布范围较小，从0.30×10-6cm/s至32.9×10-6cm2。比较培养模型，使用一系列fa值为Chips（图6B）和Transwells（图6C）绘制了四条非线性半对数回归线。基线值（紫色）来自初始fa数据集，并由GastroPlus补充。使用GastroPlus 9作为所有化合物的预测fa获得GastroPlus值（黑色）。Pham fa值（绿色）是从支持信息中获得的（Pham The，2013）。组合数据集（红色[Chip]或蓝色[Transwell]）是基线值和Pham数据集的组合，以提供最完整的数据集。fa值的详细选择如表S3所示。对于芯片，基线生成了一条非线性半对数回归线，y=-27.43+37.78 log（x），相关系数r 2=0.79。GastroPlus值的半对数拟合为y=25.65+10.17 log（x），r 2=0.41。Pham的y值为-26.84+35.39 log（x），r值为0.65。组合数据集的y=-31.75+37.48 log（x），r 2=0.66。对于Transwells，基线半对数线拟合为y=7.93+24.97 log（x），r 2=0.82。GastroPlus值为y=18.14+35.74 log（x），r 2=0.59。Pham的对数（x）为y=11.42+23.55，相关系数r=0.83。组合数据集的y=9.27+24.71 log（x），r 2=0.83。在Transwells中，r 2值的范围为0.59-0.83，而Chips的r 2值范围为0.41-0.79。数据表明，在芯片中培养的Caco-2细胞比金标准Caco-2 Transwell模型具有更宽的IVIVC范围，但具有相对相似的预测程度。
4. 讨论

复杂的体外模型（CIVM）在还原论体外模型（如Caco-2 Transwells）和临床前体内模型（如啮齿动物、犬和非人灵长类动物）之间架起了一座桥梁。CIVM包括微图案共培养物、3D微组织（球体和类器官）、3D生物打印组织和/或微流体系统（Baran，2022）。在这里，我们试图使用监管机构批准的细胞系（Caco-2）来验证商业上可获得的微流体芯片系统，并将其与唯一批准的用于评估API渗透性的体外模型Caco-2 Transwells（FDA，U.，M9 Biopharmaceutics Classification system Based Bioexcessments，2021）进行比较。
传统的体内渗透模型，如大鼠单程肠灌注（SPIP）（Dubbelboer，2019；Ungell，1998；Fager-holm等人，1997；Cao，2006；Fagerholm等人，1996；Amidon等人，1988）、肠开放、半开放和闭环灌注，将药物吸收定义为穿过肠道的有效渗透性（Peff）（Lennernas，1998；Lenneras，2007）。Peff量化了进入和离开肠段的灌注API浓度的质量平衡（Amidon等人，1988；Lozoya-Agullo，2018；Parr，2016；Doluisio，1969）。在LennernAs等人的研究中，16种模型API在健康志愿者的空肠中进行了区域灌注，并与临床前雄性Sprague-Dawley大鼠空肠和Caco-2通透性模型进行了比较（LennernAs，1998；LennernAs，1997）。对于安替比林，人类Peff的范围为3-4×10-4 cm/s，类似于预计的Caco-2 Peff为2-3×10-4 cm-s。相比之下，阿替洛尔和特布他林的人类Peff比预计的Caco-2值高50倍（Lenneraas，¨1998）。他们得出结论，Caco-2 Peff与人类Peff在高渗透性API方面很好地结合，但低渗透性API需要额外的缩放因子（Fagerholm等人，1996）。尽管啮齿动物SPIP模型预测人类Peff的准确性很高，但这些模型需要高水平的技术专长，吞吐量低，并存在伦理问题。非体内渗透模型，如Ussing小室（Clarke，2009；Lenneras等人，1997；Sjoberg，¨2013；Soderholm，¨1998）和Transwells，根据上皮膜受体侧的出现率评估表观渗透性（Papp），并允许测量组织电生理学。在这两种模型中，Ussing Chambers使用从小鼠、大鼠、猪和人类身上切下的分离肠组织，但需要获得新鲜的切除组织和技术专长（Clarke，2009；Lenneras等人，1997；Sjoberg，2013；Soderholm，1998；Gleeson和McCartney，2019；Lundquist和Artursson，2016）。Transwell模型被许多人认为是金标准模型，并被列为美国食品药品监督管理局工业指南中唯一批准的体外模型，用于确定生物制药分类系统（美国食品药品管理局，U.，M9基于生物豁免的生物制药分类系统，2021；Artursson等人，2001）。这些模型中的Papp可以从心尖到基底外侧（A到B）和基底外侧到心尖腔（B到A）进行测量（Hubatsch等人，2007）。虽然在Transwells和Ussing室中测量Papp可以提供更高的通量，并且在体内更具成本效益，但这些简化的模型并不能完全概括药物吸收中涉及的复杂机制生物学。CIVM可以弥合高阶组织模型和简单体外模型之间的差距。微流控芯片建立了一个可控的微环境，可以概括天然组织的结构和功能复杂性。随着CIVM市场的不断增长，有必要根据现有模型验证这些模型，以确保它们在药物发现中的相关性超越新颖性。
尽管Caco-2 Transwell测定法在20世纪90年代得到了广泛的评估，但存在一些局限性，例如低渗透性和副细胞专用原料药的可预测性较差（Skolnik，2010）。自2010年代初以来，微流控芯片中的Caco-2已被研究用于重建疾病病理和微生物组-宿主相互作用（Kim，2012；Kim和Ingber，2013；Tan，2018；Shim，2017；Delon，2019）。然而，这些模型大多局限于“培养皿中的疾病”或毒理学测定，并且没有针对药物吸附或药物开发目的进行适当的验证。使用17种模型API，从高渗透性（fa>85%）到中等低渗透性（fa≤85%），以及两种零渗透性荧光标记，我们评估了在静态Transwell和动态Chip条件下生长的Caco-2调用的API渗透性。众所周知，培养条件会影响实验室的渗透性（Hayeshi，2008），因此，在同一个实验室中生成Transwell和Chip数据对于强有力的验证至关重要。从结果来看，高渗透性API（fa>85%）在安替比林等模型中的形成相似：38.5×10-6cm/s（Transwell）和32.9×10-6cm-s（Chip）。在测量中低渗透API（fa≤85%）时，Transwells的值低于芯片中的值。阿昔洛韦（Transwell:0.31×10-6cm/s vs.Chip:1.09×10-6cm-s）和那多洛尔在Chips中的渗透性比Transwell:0.06×10-6Cm/s vs.Chip:0.30×10-6cm/s）高出近5倍。当将我们的实验Papp数据与已发表的值进行比较时，我们的数据呈现出适当的趋势，但依那普利和纳多洛尔等例外情况除外（表2）。两种模型之间低-中等API渗透率的差异可能是由于动态芯片条件增加了对天然组织的基础渗透率，以及Kultong等人（Kultong，2021）报告的其他转录组变化。
据我们所知，这是第一份最终验证商业化肠道芯片模型渗透性的手稿。Amirabadi等人（Amirabadi，2022）创建的一种新型双层微流体系统以50 mL/h的速度使用猪肠外植体（FSS为3.5±0.5×10-4达因/cms2），并报告Papp为15.7-29.7×10-6 cm/s（安替比林）和6.8-9.5×10-6 cm-s（阿替洛尔）。这种抗pyline Papp与我们的数据类似，但他们报告的阿替洛尔Papp比我们的高出约10倍。Tzanova等人也观察到了这一趋势，他们在其中验证了一种无细胞中流体系统，该系统使用PermeaPad®96孔板，使用七种化合物：阿替洛尔、咖啡因、酮洛芬、氢化可的松、布洛芬、对乙酰氨基酚和吡嗪酰胺（Tzanova，2023）。他们报告的Papp为35.27±0.59×10-6cm/s（咖啡因）和15.37±1.81×10-6cm-s（酮洛芬），与我们的观察结果一致，但阿替洛尔是一个异常值。Ungel等人和Sjoberg等人使用含有25种化合物（包括安替比林、普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔和雷尼替丁）的Ussing室对人体肠道组织进行了评估（Sjoberg，¨2013；Ungel，2002；Ungel和Karlsson，2003）。切除的人结肠中高渗透性化合物的Papp为54.6±13.0（安替比林）、35.4±14.2（普萘洛尔）和18.8±4.00×10-6cm/s（美托洛尔），这也与我们的数据一致。同样，切除的人结肠中低渗透性化合物的Papp为1.27±0.64×10-6cm/s（阿替洛尔）和0.62±0.29×10-6cm-s（雷尼替丁），也与我们的Transwell Caco-2发现相匹配。这些结果突显了我们的数据集如何与天然组织的数据集保持适当的趋势，并且Transwell系统是验证新模型的适当对比。
为了验证体外体内相关性（IVIVC），我们绘制了两种培养模型中已发表的人fa与Caco-2 Papp的函数关系图（图6）。人fa是在运输到肝门静脉之前渗透穿过肠上皮的API总量，提供了与Transwells相比的结果，表明Chips的变异性。然而，无论培养条件如何，这两种模型都表现出相似的预测能力。我们的IVIVC与Sun等人（Sun，2002）的广泛数据集非常吻合，当时比较了20种API在人体空肠通透性（通过单次原位肠灌注研究获得）与Caco-2通透性（通过文献获得）之间的关系。对于pH 6.5和7.4的所有原料药，相关系数（r2）分别为0.73和0.51。在Guo等人最近发表的一篇论文中（Guo等人，2024），他们使用7种模型化合物（安替比林、普萘洛尔、雷尼替丁、阿替洛尔和呋塞米）比较了Transwell和他们的新型无泵器官芯片系统中Caco-2/HT-29的渗透性。虽然我们的芯片范围（0.41-0.79）与他们的IVIVC（0.71）相匹配，但他们的Transwell IVIVC（0.31）超出了我们的范围，但这是由于包括了具有更高基础渗透率的HT-29。总体而言，这些相关性突出表明，Transwell和Chip培养模型在这些API渗透率研究中具有相似的预测性。
与Transwells的21天生长期相比，使用Chips后，Caco-2在7天的生长期内需要更少的维护。在机械剪切应力下，Caco-2极化为卷曲的绒毛状结构（Kim，2012；Kim和Ingber，2013；Kasendra，2020；Kasendra2018；Kulthong，2020；Shim，2017）。细胞重组是小肠对机械剪切应力的自然反应。在22小时的动态芯片生长条件下，Caco-2表现出垂直移动到最大高度130µm，表面积增加了1.7倍（Kim和Ingber，2013；Shim，2017）。同样，我们在荧光图像中观察到7天后Caco-2的复杂形状。绒毛状结构的存在增加了表面积，为吸收和产生Papp差异创造了更多机会，与Transwells相比，Chip中低渗透性化合物的渗透性增加。Kim等人在2012年（Kim，2012）记录了这种行为，他们在静态和流体条件下测量了FITC葡聚糖20 kDa的渗透性。他们注意到，随着细胞高度的增加（与静态相比增加了约3倍），剪切应力下的渗透率更高。鉴于肠道环境的复杂性（肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、Paneth细胞、粘液和微生物组），实现一个包罗万象的模型是困难的。这种简化论的Caco-2细胞模型消除了验证研究中的混杂变量，应该成为构建更高层次复杂性的坚实基础。根据我们目前的模型，还有一些额外的考虑因素可以进一步增加肠道通透性模型的复杂性。例如，众所周知，聚二甲基硅氧烷（PDMS）主要吸附有机分子，这表明其应用存在局限性（Li等人，2009）。虽然所提出的Chip-Papp方程通过测量根尖出口浓度来解释吸附，但探索微流体装置的替代材料可以克服这些局限性并提供更广泛的应用。在Transwell和Chips中引入转运蛋白检测来量化被动或主动吸收将进一步加强这些模型。结合不同的上皮细胞，如活检衍生的或iPSC衍生的肠类器官，可以克服Caco-2细胞系的一些局限性。由于类器官具有更具功能相关性的细胞群（Kasendra，2018；Sato，2011；Van Dussen，2015；Wright，2023），具有体内类转运蛋白和离子通道特征（Múnera，2017），因此有可能重新描述API渗透性测定的肠道环境。此外，在胃肠道环境中，粘液屏障是吸收的第一个物理屏障，并可能影响两种培养模型中API的渗透性（Boegh，2014；Larhed等人，1998）。整合粘液或功能杯状细胞将增加生理相关性，尽管这种策略可能会对微流体通道中的流动造成问题。尽管如此，这些策略将加强肠道CIVM的生物预测能力，从而加快治疗疾病药物的发现和配方优化过程。
5.结论

在这里，我们基于美国食品药品监督管理局生物制药分类系统，在已建立的芯片系统中提供了19种参考化合物的全面概况，作为评估药物渗透性的临床前工具。两种模型中都存在渗透性差异，如安替比林与纳多洛尔的对比所示，Transwells的渗透性差异接近500倍，而Chips的差异为40倍。然而，就体内外相关性而言，Transwells和Chips在预测特征方面表现相似。这两种模型在制药行业都有实用性，Transwells可用于高通量发现工作，而Chips则提供了体外和体内之间的互补模型。我们预计芯片将继续作为一个补充系统，根据3R原则弥合知识差距，完善和减少对动物模型的严重依赖。据我们所知，这是芯片上肠道模型的首次验证，并确立了其在制药行业的实用性。

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