PCR 实战宝典 No.9：其他PCR技术进展

空白派

第一节 反向PCR技术

PCR 技术主要用来快速、大量获得特定已知序列的 DNA 片段。常规的 PCR 技术是用 于扩增两段已知序列之间的 DNA 片段，而对于已知序列侧翼的未知 DNA 序列的扩增，则   毫无办法。但是，在很多时候，人们又非常渴望了解某些特征性遗传标记侧翼的序列，如转 座子或病毒是整合至基因组的什么位点、某一缺失基因丢失了哪一部分、某一 cDNA 的启 动子是什么等。在反向 PCR 技术出现以前，对上述问题的解决办法是:一般首先用 λ 噬菌 体及其衍生物作载体构建相应的基因组文库，接着用杂交的办法获得相应的阳性克隆，然后 用多拷贝质粒再构建次级文库，再进行杂交，最后进行测序。整个过程工程庞大。正是基于 这些原因，TrigliaT 和 OchmanH 等人在常规 PCR 的基础上建立了反向 PCR 技术 (inverse poly-merase chain reaction，IPCR)，大大减少了实验的工作量，加快了实验进程。
1、反向 PCR 技术的概念和特点

在已知序列的核心区边侧设计一对反向引物，由于它们的 3’端方向相反，因此不能够 以两引物间的序列为模板形成 PCR 扩增;但当以适当的限制性内切酶裂解含核心区的 DNA， 并用 DNA 连接酶将含有已知序列核心区的 DNA 片段的末端连接形成环状分子，则可以产 生适合于上述两条反向引物 PCR 扩增的模板 DNA，即从两引物分别向未知序列区域延伸到 限制性内切酶切割位点的未知序列。其特点是 PCR 的引物同源于环上核心区的末端序列， 但其方向相反，使链的延伸经过环上的未知区而不是核心区，即扩增的产物含有已知核心区 序列旁边的未知序列。见图 9.1。




图 9.1 IPCR 示意图


2、反向 PCR 的应用进展

(一)用 IPCR 对已知 DNA 区段边侧区域的扩增
反向 PCR 的应用已经证明该方法可以避免不方便的克隆和亚克隆步骤，而获得已知 DNA 区段边侧区域未知序列的 DNA 片段。例如用反向 PCR 扩增 E.coli 天然分离物中转位 插入序列 ISL.的边侧序列;用于编码疟原虫(Plasmodium falciparum)主裂殖子表面抗原前 体的基因;用于获得转录基因的 5'端或 3'端的边侧区域。
(二)用 IPCR 获得启动子序列
在后基因组时代，产生了大量的 EST 及完整的 cDNA 序列，但是由于它们缺乏启动子 等调控序列，因而整个基因序列是不完整的，这对研究基因的表达调控和功能极为不利。通 过 IPCR 来获取启动子可大大降低工作量。但是，用 IPCR 克隆启动子与一般的 IPCR 的差 别在于:它只要克隆已知序列单一方向的外缘片段。因此，对消化基因组 DNA 的限制性酶 的选择就有所不同，该限制性酶的识别位点可位于已知序列上，但不能在引物之间。
(三)用 IPCR 鉴定插入失活基因
在大规模的微生物功能基因组研究中，其中一个很重要的方法是利用转座子随机插入构 建庞大的微生物突变体库，随后对突变体进行功能筛选和表型鉴定，该方法在致病微生物毒 力基因或毒力相关基因研究中是比较常见的，如信号标诱变技术 (signature-tagged mutagenesis，STM)、体内表达技术(in vivo expression technology，IVET) 等。在植物基因组功能研究中，常利用根瘤杆菌的 T-DNA 进行基因的插入失活，然后用 IPC 鉴定相关基因。
第二节 巢式PCR

巢式 PCR(nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR)亦 称为嵌合 PCR，通 过设计“外侧”、“内侧”两对引物进行两次 PCR 扩增，外侧引物的互补序列在模板的外侧， 内侧引物的互补序列在同一模板的外侧引物内伽在田一过外伽物扩增含有日的靶序列的较 大 DNA 片段，然后用另一对内侧引物以第一次 PCR 扩增产物(含有内侧引物扩增的靶序 列)为模板扩增，使目的靶序列得到第二次扩增，从而获取目的靶序列。这样两次连续的放 大，明显地提高了 PCR 检测的灵敏度，保证了产物的特异性。对于极其微量的靶序列，应 用巢式 PCR 技术可以获得满意的结果。目前，巢式 PCR 主要可以分为五种:常规巢式 PCR， 半巢式 PCR，反转录巢式 PCR，共有序列巢式 PCR 和特种异巢式 PCR。
1、常规巢式 PCR

巢式 PCR 是一种 PCR 改良模式，它由两轮 PCR 扩增和利用两套引物对所组成，首先 对靶 DNA 进行第一步扩增，然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩 增，第二次 PCR 引物与第一次反应产物的序列互补。使用常规巢式引物进行连续多轮扩增 可以提高特异性和灵敏度。
巢式 PCR 应用简单，所需条件与常规 PCR 相同，但与常规 PCR 相比，进一步提高了 反应的特异性与灵敏性，在应用中极为广泛。对于用常规 PCR 方法难以扩增出的样品，可 以尝试使用巢式 PCR。
在临床检测中，还会用到单管巢式 PCR 方法，单管巢式 PCR 是在传统巢式 PCR 的基 础上将两对 PCR 引物作特殊的设计，巢式外侧两个引物为 25bp，退火温度比较高(68°C); 巢式内侧两个引物为 17bp，退火温度较低(46°C)，PCR 反应液的其它成分与一般 PCR 相 同。这样，通过控制退火温度(68°C)使外侧引物先行扩增，经过 20~30 次循环后(第一次 PCR)，再降低退火温度(46°C)使内侧引物以第一次 PCR 产物为模板进行巢式扩增，该 PCR 的灵敏度可达到每毫升样品检出 0.3 个淋球菌，而传统的一步 PCR 法只能检测到 3 个 淋球菌。
2、半巢式 PCR

半巢式 PCR 与巢式 PCR 原埋相同，只是在第 2 轮 PCR 反应中使用的引物有 1 条为第 1 轮 PCR 的引物，这种利用三条引物进行两次 PCR 扩增的方法称为半巢式 PCR   (semi-nested PCR)，半巢式 PCR 与巢式 PCR 应用条件基本相同。
半巢式 PCR 较巢式 PCR 反应特异性有所降低，易造成非特异产物，可通过提高退火温 度，从常用的 55°C提高为 60°C。从而使模板与引物之间的识别特异性提高，以提高反应的 特异性。半巢式 PCR 多采用第一轮产物直接稀释作为第二轮循环模板，此稀释混合物中的 引物和模板对于第二轮扩增有一定干扰作用，易造成背景高、非特异产物多的缺点，通过对 第一轮产物的初步分离获得纯化的核酸产物，再作为第二轮循环模板可得到更为理想的结果。
当模板 DNA 含量较低时，一次 PCR 难以得到满意的结果，需要进行两轮 PCR 扩增， 与巢式 PCR 相比，在基因的 5'末端或者 3'末端无法设计出两条引物——外引物和内引物， 只能设计出一条引物的情况下，宜采用半巢式 PCR。杜慧等使用半巢式 PCR 成功鉴定出盲 传为阴性的风疹病毒基因型，丰富了我国风疹病毒的基因库;马杰等利用半巢式 PCR 技术 成功鉴定出区域内肾综合征出血热患者的主导基因型。
3、反转录巢式 PCR

反转录巢式 PCR(RT-nested PCR)是在反转录 PCR 的基础上发展起来的，在通过反转 录获得 cDNA 的基础上，对目的基因进行巢式 PCR 扩增。它和简单的反转录 PCR 一样是用 于检测某种 RNA 是否被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高、可靠性更强。 通常用于拷贝数较低的 RNA 的扩增，例如扩增丙型肝炎病毒(HCV)感染者体内的 HCV 基因。
反转录巢式 PCR 在分子生物学实验中具有广泛的应用，通常用来获取拷贝数较低的基 因，尤其是在获得 RNA 病毒基因方面。有学者利用反转录巢式 PCR 方法成功获取 HIV-1 主要流行株 Gp120 基因的序列特征，表明该方法是一种检测 HIV 病毒的快速、简便、易行 的方法。黄昆等也利用反转录巢式 PCR 方法扩增了重型血友病患者凝血因子VIII(FVIII)基因 内含子 22 倒位，证明该方法是一种快速准确的内含子 22 倒位检测方法。
4、共有序列巢式 PCR

共有序列巢式 PCR(consensus nested PCR)，又称为共有引物巢式 PCR(consensus primer nested PCR)，根据同一种属内较为保守的序列，设计简并引物，通常第一轮 PCR 引物的简 并碱基较多，第二轮 PCR 引物的简并碱基较少一些，扩增长度为 200~300bp。引物通常设 计在能够区分微生物的不同亚型的区域内。对于某一种生物，例如病毒，种属内型别很多，但检测样本中的病毒型别又不确定，使用共有序列巢式 PCR 扩增获得目的序列，进而通过 测序获得未知微生物的信息，是一种敏感而又简便易行的检测方法。
共有序列 PCR 常用于检测临床样品中的未知微生物，通过 PCR 扩增获得 DNA 模板， 通过测序以确定未知微生物。Oskar 等利用共有序列巢式 PCR 从白鲷中成功分离出 WBRV 反转录病毒株 A-127/06。Vandevanter 等利用共有序列巢式 PCR 检测了临床样本或细胞培养 中的 21 种疤疹病毒，通过测序发现其中的 14 种是以前没有报道过的。黄欢欢等利用共有序 列巢式 PCR 技术成功证明耐黏菌素菌株及 mcr-1 基因在住院患者及体检人群中均存在一定的流行率，为临床抗感染治疗带来潜在风险。
5、种特异性巢式 PCR

微生物在其分类中有严格的分类方法，属于同一种的微生物在进化中形成了一部分保守 的基因序列，针对种特异的基因设计引物，能够区分同一属内不同种的微生物。在种特异 PCR 中，扩增基因一般选择在较为保守的 16SrRNA 和 23SrRNA 内。近几年来国外学者采 用不同的分子生物学方法对细菌的 16SrRNA 进行研究，得到了广泛的细菌 16SrRNA 的序列 库。现在人们已经认同 16SrRNA/rDNA 基因序列可用于评价生物的遗传多态性和系统发生 关系，在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时， 由于分离培养技术的限制，难以获得它们的纯培养进行生理生化学等指标的分析，这样 16SrRNA/rDNA 序列分析的优越性就体现出来了。
Sturbaum G.D.等利用种特异性巢式 PCR 联合限制性片段长度多态性(RFLP)对一种寄 生虫 Cryptosporidium parum 的卵进行检测。他们设计的引物位于 18S RNA 区域内，通过对 1 个、2 个、3 个、4 个、5 个、7 个和 10 个卵的检测来评价此种 PCR 方法的敏感性，发现 利用 PCR 扩增单个卵基因是可行的，但敏感性需要进一步提高。Matsuki T 等四利用针对于 16S rDNA 的属特异和种特异 PCR 来检测双歧杆菌(bifdobaecteria)。他们提取人排泄物中 的基因组，发现在成年人中链状双歧菌(Bifidobacterium catenulatum)菌群是最常被检测出 来的菌群，在吃奶的孩子中，短双歧菌(Bifidobacterium breve)是最常被检测出来的菌群。 利用针对于 16S rDNA 区的实时定量 PCR 可望检测出排泄物的不同菌群的数量，此种技术 对于检测肠道中的菌群的动态分布提供了很好的办法。Salotra P.等利用针对于莱什曼原虫 (Leishmania donocani)动力体(Kinetoplast)kDNA 的种特异 PCR 检测临床样品中 Leishmania donovani 的感染状况。
第三节 多重PCR

多重 PCR (Multiplex polymerase chain reaction，MPCR)是在普通 PCR 的基础上，在同 一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩 增，从而得到多个目的片段，结合一定的检测手段进而实现同时对多个靶标进行诊断的技术。 自 Chamberlain 于 1988 年首次提出这个概念以来，MPCR 已经应用于许多领域，包括基因 突变与缺失、基因分型与定量、遗传检测、伴药诊断等。多重 PCR 主要有以下 3 个显著特 点:1高效性，即在同一 PCR 反应管内可同时检出多个基因、多种病原微生物，或对有多 个型别的目的基因进行分型，特别是用非常微量的标本材料就可检测多个基因，大大节省样 本用量。2系统性，多重 PCR 很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、 性病、无芽胞厌氧菌、战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。3经济简便性，多种基因在同 一反应管内同时检出，大大节省检测时间，节省试剂消耗，降低加样工作强度，节约经费开 支，可更快捷地为临床提供更多诊断信息。
MPCR 所涵盖的范围广，能够同时对多个靶标进行检测，大幅提升检测效率的同时， 还降低了检测成本。随着科学技术的发展，MPCR 技术在扩增和检测方面已经取得了许多新 的突破。在扩增方面，不再局限于在同一反应管中进行扩增，而是将不同的引物对和模板分 散于相对独立的空间中进行扩增;在检测方面，也不断有新的超多重检测技术的出现。目前 多重 PCR 主要可以分为三种:多重荧光定量 PCR，基于微流控的多重 PCR 和基于固相载体 的多重 PCR。
1、多重荧光定量 PCR 技术

(一)基于荧光探针的多重 PCR 技术
多重荧光定量 PCR (Multiple fluorescence quantitative PCR)技术是在荧光定量 PCR 技 术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多 个靶标的实时定量检测。TaqMan 水解探针 (Hydrolysis probes) 是多重荧光 PCR 体系中常 用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不 同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的 TaqMan 水解探针，将上述探针及相应的扩 增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。目前已成功在单管中实现两重 、 三重 PCR 扩增和检测体系，并实现对部分病毒样本的扩增。分子信标(Molecular beacon)   是多重 PCR 体系中另一种常用的探针，当体系中不存在特异性的靶标时，分子信标会自发 形成茎环结构，淬灭基团与荧光基团相互接近从而发生 FRET，不会产生荧光。如果体系中 存在特异性的靶标，在一定的条件下，茎环结构会打开并且与靶标进行复性，从而产生荧光 信号。那么在同一个反应体系中加入几种靶标特异性的分子信标就能够实现对多个靶标的同 时检测。目前基于分子信标已实现了针对不同的靶标的四重、五重 PCR 的检测。
(二)基于探针编码的多重 PCR技术
基于水解探针和分子信标探针的多重荧光定量 PCR 技术的优点是简便快捷，然而受仪 器荧光检测通道的限制，往往最多只能达到四重或五重检测。组合探针编码(Combination probe coding)技术的开发，使得目前的多重实时核酸扩增可检测的靶标数目多于仪器可检 测的数目。通过对 4 种不同的荧光基团进行相互组合可以形成 15 种指示探针，在多重反应 体系中加入多种靶序列特异的置换探针(Displacing probes)，那么在检测通道有限的情况 下仍能够实现对多种不同的靶标同时进行扩增和检测。Huang 等利用多色组合探针编码技术 (MCPC)实现了对 8 种食源性病原菌的鉴定以及通过 4 色组合探针编码技术实现了对 15 种 不同型别的 HPV 病毒进行分型。




图 9.2 荧光元素之间的组合

(三)基于荧光染料的多重 PCR技术
非特异性的荧光染料嵌入到 DNA双链小沟中后，在特定的激发光激发后将会产生一定 波长的荧光。以此为基础发展了熔解曲线(Melting curve)分析法(图9.3)。Singh等利用 多重实时 PCR熔解曲线分析的方法，成功地实现了同时对氨苄西林、链霉素、磺胺、四环 素、氯霉素耐药的沙门氏菌的检测与辨别。针对不同的型别设计了特异性的引物对，从而对 模板进行扩增生成不同的扩增子，扩增子之间Tm值各有差异，最后通过熔解曲线峰的位置 进行鉴别。在熔解曲线分析技术的基础上发展而来的高分辨率熔解曲线技术是一种利用饱和 染料，借助高分辨率的仪器，实现对单个核苷酸熔解温度不同从而形成不同形态熔解曲线，进而对基因进行分析的新技术，它具有极高的灵敏度，能够检测出单个碱基之间的差别，目 前主要应用于单核苷酸多态性分析、甲基化分析、基因突变、基因分型等领域。



图 9.3多重熔解曲线

(四)基于荧光探针熔解曲线的多重 PCR技术
由于荧光基团本身发射的不是单一波长的荧光，而且PCR仪对不同荧光基团发射的荧光 信号的区分度有限，所以现有的 PCR仪只能检测4–5种不同的荧光信号。而基于荧光染料的 多重PCR技术由于染料不具备特异性的识别能力，所以同一反应体系中通常只能使用一种荧 光染料。为了弥补这两种方法的不足而开发出来的荧光探针熔解曲线技术(Fluorescence probe melting curve technique)具有成本低、多重检测能力更强的优点。通过在靶序列中选 取相对保守的区域设计通用扩增引物，然后在引物对之间选取差异度较大的区域设计能够识 别各种目标核酸序列的特异性探针，探针在扩增的过程中不会被完全水解，并且根据检测通 道的不同将探针进行分组，每个通道中包含多个特异性探针，通过调整探针的长度或GC含 量对每条探针的Tm值进行人为的调控，使得同一检测通道内针对不同靶标的检测探针Tm值 都间隔合适的差值，每个荧光通道均可定性检测多个靶标，最后通过熔解曲线进行分析。 Liao等利用荧光探针熔解曲线技术成功地实现了对15种高危型HPV的分型以及实现了对48 种人类单核苷酸多态性的分型和分析。
2、基于微流控的多重 PCR技术

基于微流控芯片 (Microfluidic chip)的多重 PCR 技术通过在芯片微孔中预装填不同的引 物对的方法将各重扩增限制在各自的独立空间内，再通过液流控制系统将模板引流到不同的 微孔中，进而在微孔中进行特异的 PCR 扩增反应，最后再进行终点定性检测(图 9.4)，从 而实现对多个靶标的区分和鉴别，该方法可有效的避免各核苷酸链之间形成二聚体甚至多聚体所导致非特异性扩增的出现，扩增效率下降，检测灵敏度和特异性降低，最终造成检测结   果假阳性或假阴性。部分研究者结合微流控技术研发了一种可以同时检测多种病原体的诊断 平台，称为“FilmArray”，该平台成功地实现了在 1h 内对 21 种常见的病毒或细菌的检测和 鉴别。有学者设计的一种微流控芯片利用双向电泳技术和多重阵列 PCR 终点荧光检测技术 实现了在全血中对不同病原菌的即时检测。多重液滴式数字 PCR 的作用原理与基于微流控 芯片的多重 PCR 的原理相似，通过芯片装置和液流控制系统产生成千上万个液滴，每个液 滴中只包含单个目的 DNA 分子，这样就可以使不同的靶标处于相对独立的空间进行各自特 异性的扩增反应，最后通过计算各靶标发生有效扩增的液滴数，从而实现绝对定量。 Jackson 等利用液滴式数字 PCR 成功地实现了对血液游离 DNA (Free DNA)中罕见癌症突变的多 重检测，利用液滴式数字 PCR 对珍贵的临床标本进行多靶标的检测，极大地提高了标本的 利用率并降低了成本。基于微流控芯片的多重 PCR 技术和多重液滴式数字 PCR 的优点是在 一定程度上避免了非特异性扩增产物的生成以及在荧光定量 PCR 的基础上增加了检测重数。 但是当模板浓度较低时，基于微流控的方法将模板分流至含特异性引物微孔中的概率降低， 易产生假阴性结果;而多重液滴式数字 PCR 的方法使每个液滴中仅包含单重引物和模板的 概率相对较低，往往一个液滴中包含多对引物或者液滴中的引物与模板为非特异性配对，另 外它对模板的要求较高，浓度过高的模板不能保证生成的每个液滴中仅包含单个目的 DNA 分子。此外在检测方面，上述两种技术都需要配合扩增的特殊性而使用到高精密度的检测仪 器，其技术的复杂性使其实现较为困难。



图 9.4 基于微流控的多重 PCR

3、 基于固相载体的多重 PCR技术

(一)基于膜层析的多重检测技术
膜层析技术 (Membrane chromatography) 是在柱层析技术上发展而来的一项技术，以膜介质为基质，偶联相应的离子交换、亲和、疏水等化学基团，制作而成的一种新型的层析介 质。膜层析技术具有简单快速并且能够自动分离液体混合物的优点，而多重PCR技术具有有 效富集目的片段的优点，将这两种技术有机地结合在一起能够形成一种灵敏度高、特异性好、 成本低、简便快速的多重核酸检测方法(图9.5)。基于胶体金标记的核酸探针和侧流试纸条 的基因方法，能够在15 min内检测出核酸样本。侧流微阵列方法能够快速、灵敏地对多种核 酸进行检测，并且不需要专门的仪器设备，这种方法以微型侧流酸检测试纸条在现场实现了 对108例献血者血型相关基因型的准确鉴定。基于膜层析的多重检测技术以其操作简单、携 带便捷等优点拓宽了可检测的范围，使检测不再局限于实验室，对于现场检测也能够实现， 但是膜层析技术中样品的阻滞、非特异性杂交等问题仍然是今后需要解决的问题。



图9.5 基于膜层析的多重检测

(二) 基于Luminex液相芯片的多重检测技术
液相芯片技术 (Liquid chip technology)被称为后基因组时代的芯片技术，也被称为 xMAP技术。它可以同时对1份标本中的100种不同目的分子进行检测，并能在30 min内检测 96个不同的样本。其液相微球编码原理为，将两种荧光染料分别用10种不同的浓度两两混合 形成10×10的荧光配比阵列，并对微球进行染色，得到100种不同荧光编码的微球。将荧光 编码且共价结合了不同捕获探针的微球悬浮于一个液相体系中，先加入待检测分子与其反应， 再加入带有荧光标记的报告分子，从而形成“微球-捕获探针-靶标-报告分子”复合物(图9.6)。 检测时，该复合物在鞘液的作用下将逐个通过检测通道，接受两束不同波长的激发光照射并 对相应的发射光进行检测，其中一束激光用于识别微球种类，即判定该种微球是对哪种特定 的靶标进行检测，另一束激光用于检测微球上报告分子的荧光强度，从而实现对待测物质的 定性和定量分析。目前，Luminex液相芯片技术已广泛的应用于各类病原微生物的检测和分 型，包括对沙门氏菌的检测和分型，禽流感病毒、传染性猴气管炎病毒和空肠弯曲菌的检测和鉴别等。虽然基于 Luminex液相芯片技术能够实现同时对多种不同病原体的检测和鉴别，   但它仅在检测方面发挥了其多通量、高效率的特性，其实质上并没有解决多重扩增中众多引 物、探针、模板间相互错配的问题。因此，未来开发出微球表面多重扩增以及 Luminex液 相芯片检测一体化的技术是核酸多重检测的重要研究方向。



图 9.6 基于 Luminex液相芯片的多重检测技术



未完待续
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