p16 基因甲基化与肺癌早期诊断

临床医师

肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。在我国肺癌是发病率最高的癌症,且发病率和死亡率迅速增长。由于绝大多数肺癌的临床诊断已属晚期,其中50 %以上的患者已不能手术 ,因此,肺癌的早期诊断显得尤为重要。近年来,随着分子生物学的蓬勃发展,已阐明肺癌的发生发展与多种基因有关,但都局限于原癌基因和抑癌基因的点突变、小片段缺失、插入等方式造成的功能丧失。近期研究表明,抑癌基因存在甲基化状态的改变,导致一些抑癌基因转录功能丧失,是抑癌基因失活的主要机制。p16 基因为一种多肿瘤抑制基因,参与多种肿瘤的发生发展,其外显子区域的甲基化所导致该基因的失活与肺癌的发生发展关系密切,尤其对肺癌的早期诊断更具有价值。本文就p16 基因及其甲基化与肺癌早期诊断的关系作一综述。
1 关于早期肺癌和肺癌早期诊断
      肺癌分为小细胞肺癌( small cell lung cancer ,SCLC) 和非小细胞肺癌( non-small cell lung cancer ,NSCLC) 。SCLC 属内分泌细胞来源的肿瘤,仅占肺癌的20 %～25 %;绝大多数肺癌是NSCLC ,占75 %～80 % ,包括鳞癌、腺癌、细支气管癌、大细胞癌和未分化癌。早期肺癌一般指癌灶局限于支气管内或支气管壁而未侵犯管壁外肺组织,或癌灶位于周围肺组织,直径< 2 cm , 且无转移者。根据新的肺癌TNM 分期方法,早期肺癌进一步分为ⅠA( T1N0M0 ) 和ⅠB ( T2N0M0 ) 两个亚分期。
      早期肺癌由于常无特殊症状而几乎不被医生和患者察觉,用常规的诊断方法也难以早期发现和早期定性诊断,加之一些肿瘤标记物仅能作为肺癌的初筛或诊断提示而不能确诊,因此肺癌的早期诊断较为困难 。目前,随着分子生物技术的研究不断深入发展,作为生命物质基础的基因,它的改变会导致各种疾病的发生,这一观点普遍被接受。基因诊断技术已日臻成熟, 给肺癌的早期诊断带来了希望。
2 DNA甲基化与肿瘤
      2. 1 DNA 甲基化　DNA 甲基化(DNA methylation) 是指生物体内在DNA甲基转移酶( DNA methylt ransferase ,DNMT) 催化下,由S2腺苷蛋氨酸( SAM)为甲基供体,将甲基转移到胞嘧啶磷酸鸟嘌呤二核苷酸( Cp G) 的5′-末端, 形成mCp G的过程。DNA 甲基化是真核生物体内普遍存在的一种基因内源性修饰。富含Cp G 序列的区域称为Cp G 岛,长约200～1000 bp ,常位于5′- 末端,是DNA 甲基化发生的高频区域,有70 %～80 %可呈现甲基化。在正常生理情况下,该区域因胚胎早期的特异性去甲基化而处于非甲基化状态。当Cp G 岛受到各种有害因素影响时,容易发生甲基化,从而导致基因沉默。目前认为,原癌基因的低甲基化水平,使其重新开放或在特定组织中异常表达,促进细胞恶性转化;而抑癌基因启动子区域的高甲基化水平,造成基因表达失活,促进了肿瘤的发生和发展。
      2. 2 DNA 甲基化与癌变的相关性　DNA 甲基化导致细胞癌变主要是抑癌基因的高甲基化状态使转录失活,从而使抑癌基因表达受限,不能正常发挥其控制细胞生长的作用,细胞过度增生,促进肿瘤的发生。其中导致转录失活的机制可能有: ①直接作用机制: Cp G 岛的甲基化可直接抑制转录因子(NFKB、E2 F、AP2 、CREB) 与基因调控区域结合;其次,DNA甲基化还可能直接抑制RNA 聚合酶活性而抑制基因的表达。②间接作用机制:甲基化DNA 与特异性结合蛋白(MeCP2 和MeCP1 ,也叫MBP 家族) 结合,增强了转录抑制蛋白( HDAC 组蛋白脱乙酰酶) 的作用,组蛋白乙酰化的水平下降,并引起它所带电荷的变化,与DNA 骨架的结合状态随之改变,进而影响染色质结构,转录被抑制。这两种机制都可间接阻碍转录因子( TF) 与DNA 结合而抑制转录。
3 关于p16 基因
      3. 1 p16 基因的来源与结构　p16 基因是Kamb 等1992 年在黑色素瘤细胞中运用染色体杂合性缺失(LOH) 分析发现的。1994 年,该基因由Kamb 和Serrano在美国盐湖城克隆出来。该基因已被国际基因组织命名为一种重要的多肿瘤抑制基因( multiple tumor suppressor 1 ,MPSM1) 。p16 基因位于9 号染色体短臂的9p21 区,全长8. 5 kb ,由2 个内含子和间隔的3 个外显子构成,靠近5′- 端的为第一外显子( E1) ,含126 个碱基对,中间的为第二外显子( E2) ,含307 个碱基对,靠近3′- 端的为第三外显子,含11 个碱基对。p16 基因的启动子长约71 bp ,位于转录启始点上游500 个bp 处。另外,启动子和E1 、E2 区含有多个可甲基化的5′-Cp G岛。E1 区有a 、b 两种不同形态,分别由两个启动子控制。a 型的mRNA 可以翻译成有活性的P16 蛋白,而b 型的在活体细胞中则不能翻译P16 蛋白, b 型的E1区位于a 型E1 区上游的20 个bp 处。p16基因5′- 端的Cp G 甲基化会阻止全长p16基因转录本的生成,去除甲基化可恢复全长p16 基因mRNA 的转录,p16 基因转录本的功能尚不清楚,但已知对维持p16 基因的功能是十分重要的。
      3. 2 p16 基因的编码蛋白　p16 基因编码蛋白是分子量为15. 84 ku 的单链多肽,P16蛋白包含了148 个氨基酸的开放阅读框架,并有4 个钩状重复序列构成了该蛋白的空间构型,像字母“L”,有一对α反螺旋形成“L”的臂,而由β发夹形成“L”的底。这种“L”型的结构提供了一个范围较大的凹面,能够在更大程度上结合外源性蛋白,这一构型为P16 蛋白最常发生改变的场所。P16 蛋白是一种细胞周期依赖性激酶(cyclin dependent kinase ,CDK) 4 的抑制因子,它通过抑制CDK4 对细胞增殖起负调控作用。CDK4 能够使视网膜母细胞瘤蛋白( retinoblastoma protein ,Rb) 的丝氨酸或苏氨酸磷酸化,这是细胞周期越过G1 检测点( G1 checkpoint ) 进入S 期的关键一步,故而Rb 蛋白的磷酸化状态是影响细胞周期稳定的一个重要因素。P16蛋白能与细胞周期素(cyclin D) 竞争性结合CDK4 。它与CDK4 结合后抑制PRb的丝氨酸或苏氨酸磷酸化, PRb 磷酸化水平下降,使某些转录活化因子(如E2 F)失活,转录因此被抑制,细胞则不能实现从G1 期到S 期的过渡而死亡,因而P16 蛋白在保持Rb 蛋白的非磷酸化状态、抑制细胞周期的进程中扮演了一个重要角色。P16蛋白这种调控细胞生长的途径称P16 /CDK4 / cyclin D/ Rb 途径。有学者还认为,P16蛋白还可能通过诱导端粒长度的改变使肿瘤细胞无限增殖受到抑制,但这一效应具体机制不明。p16 基因发生突变,它的编码蛋白表达水平将会下降或消失,失去原有的生物学功能, 参与肿瘤的发生。
      3. 3 p16 基因的失活机制　p16 基因系多肿瘤抑癌基因,与多种肿瘤的发生发展有密切关系。导致基因异常的机制可能包括: ①p16 基因的缺失:其中有纯合型缺失(homozygous deletion , HD) 和杂合型缺失(loss of heterozygosity ,LOH) 。在纯合型缺失中p16 基因的mRNA 和蛋白均无表达。食管癌中该机制发生率最高, 达60 %。②p16 基因的点突变:有无义突变、错义突变和移码突变。黑色素瘤中p16基因的点突变率高达78. 5 %。③p16基因5′- Cp G 岛的异常甲基化: 是该基因又一重要失活机制。大量资料表明,尽管p16 基因的纯合型缺失发生率最高,达40 % ,但p16 基因5′- Cp G岛的异常甲基化与早期肺癌有密切关系。何建猷等用甲基化特异性PCR (MSP) 法分别检测30例NSCLC 组织、30 例癌旁组织和3 例正常组织中p16 基因第一外显子的Cp G 岛异常甲基化情况,发现30 例肺癌组织中有12 例(40 %) 检测到p16 基因的5′- 端Cp G岛甲基化,而癌旁组织和正常组织中p16 基因无一例发生甲基化( P < 0. 001) ,认为p16 基因5′- 端Cp G 岛的甲基化是p16 基因在NSCLC 的主要失活机制。Kim 等研究发现,吸烟能诱导p16 基因甲基化的发生。
4 p16 基因甲基化与肺癌1 ]0 j; P% N$ j& b
      4. 1 p16 基因甲基化在早期肺癌组织中的异常表达　近年来,有关p16 基因异常表达与肺癌发生关系的研究取得了一定进展。Esteller 等应用聚合酶链式反应(PCR) 检测22 例NSCLC 患者,有41 %的患者p16 基因有异常甲基化。为了进一步了解p16 基因的甲基化与肺癌的关系,彭猛青等将56 例肺癌患者分组,提取患者基因组DNA 并在DNA 的Sma Ⅰ/Sma Ⅱ双位点给予酶切,通过PCR 方法对DNA 扩增并分析DNA 甲基化情况,结果显示,在正常情况下p16 基因第1 外显子的5′- Cp G岛有Sam Ⅰ和Sam Ⅱ的特异性酶切位点, 当DNA 甲基化后, Sam Ⅰ和Sam Ⅱ酶便识别不了这些位点而不能切割DNA ;用p16 基因的第一外显子特异引物进行PCR 扩增时,被甲基化的DNA 扩增出340 bp 的片段,未甲基化的DNA 由于被酶切而没有相应的DNA 片段;Cp G 岛还存在Hha Ⅱ、Eag Ⅰ、Acc Ⅱ、Cfo Ⅰ等甲基化位点,所以实际的甲基化率可能还要高。同时部分患者在临床诊断前就检测出该基因的高甲基化状态。Belinsky等研究发现,在肺鳞癌的发生发展中,从细胞的过度增生、鳞状化生到原位癌的不同阶段抑癌基因p16 甲基化的发生率分别达17 %、14 %和50 % ,p16 基因甲基化在肿瘤组织和癌前病灶均有发生,提示检测p16 基因甲基化对肺癌早期诊断有较大意义。彭猛青等的研究结果还显示肺癌组织中p16 基因甲基化率为28. 6 %(16/ 56) , 28 例肺部良性病变组织无一例甲基化,认为p16 基因的甲基化改变在肺癌组织中具有高度特异性。有学者用多聚酶链反应、原位杂交及免疫组织化学这三种方法检测p16 基因的DNA 甲基化状态、p16 基因的mRNA 和P16 蛋白表达水平并分析这三者之间的关系,结果显示p16 基因启动区的高甲基化与mRNA和蛋白表达呈负相关,且在肿瘤细胞的分化、淋巴结转移及患者生存率方面具有统计学意义。在p16 基因甲基化阳性的标本中用免疫组化检测到有94. 4 %的P16 蛋白表达缺失;p16 基因甲基化阳性并有P16蛋白表达缺失的NSCLC 患者的淋巴结转移率为74. 4 %。随着癌组织分化程度的降低, 该基因的甲基化水平上升( P =0. 048) 。p16 基因甲基化程度越低,患者术后3 年以上的生存率就越高。这三种方法的联合使用还可增强p16 基因甲基化检测的敏感性,提高其阳性检出率。
      4. 2 p16 基因甲基化在早期肺癌痰液中的异常表达　目前,应用较为广泛的肺癌诊断方法仍是脱落细胞的检查,而痰液是临床上容易获得的标本。痰脱落细胞中p16 基因甲基化状态的改变可作为临床最具前景的肺癌早期诊断的指标。Belinsky等发现p16 基因的Cp G岛甲基化和早期NSCLC 密切相关。他的研究资料显示,43 %(3/ 7) 的NSCLC 患者痰液脱落细胞中检测到p16 基因启动子区域的异常甲基化,19 %(5/ 26) 的高危人群中检测到同样变化, 在痰液脱落细胞中检测到有p16 基因甲基化的患者在两年后确诊为NSCLC。Palmisano 等用敏感的MSP法检测p16/ MGMT 基因,发现100 %的肺鳞癌患者痰液中可检测出p16 基因的甲基化,在临床诊断肺癌前5～35 个月,患者的痰脱落细胞中就可检测出p16 基因异常甲基化。刘晋纬等研究得出, 74 %(70/ 94) 的肺癌患者痰液标本中检测到了p16 基因异常高甲基化,与传统的细胞学检测(46. 8 %) 相比,痰标本中p16 基因甲基化检测对肺癌诊断的灵敏度更高。这些资料可以表明p16 基因在早期肺癌中就有异常甲基化改变,研究者认为p16 基因异常甲基化是肺癌早期常发生的事件,为诊断早期肺癌提供了理论依据。
5 问题与展望
      大量研究表明,p16 基因高甲基化水平与肺癌密切相关,p16 基因甲基化检测对肺癌早期诊断有一定价值,并已取得可喜的成果。但是仅采取一种方法或一种指标进行诊断不免片面, 可能存在着漏诊。p16 基因的检测技术还不十分成熟,技术方法尚未形成统一的标准,存在各种检测结果不一致的现象;p16 基因系多肿瘤抑制基因,它对所有肿瘤起作用,还是仅对某种或某几种肿瘤起作用,还不十分清楚;此外,p16 基因甲基化的具体机制尚不清楚,有待进一步研究。这些都是目前p16 基因研究中存在的问题和困难。但随着分子生物学的不断发展,相信通过深入研究肺癌相关基因异常表达在肺癌发生发展过程中的内在规律和对多基因异常表达的综合分析,将有可能建立早期肺癌基因诊断模式,使肺癌分子诊断有一个质的改变,达到早期发现、早期诊断、提高肺癌治愈率的根本目的。