如何确定pcr退火温度？以及程序设计？

二维码

各位大神，之前自己设的引物Tm一个68 一个66点多，我退火跑55，56,58，都跑不出来，重新提了RNA，浓度在1729，重新找公司设计的引物FW Tm 66.5°C RV Tm 68.4°C ，今天跑了两次梯度温度61,62,63,64,65，都跑不出来，只有marker有条带是什么情况

原文地址：https://www.zhihu.com/question/436728937

长长的路

PCR一般包括三个步骤:变性，退火，延伸。其中，退火过程中温度是非常重要的一个参数，温度过高会导致产量降低、甚至得不到产物，温度过低又会导致非特异扩增。
退火温度设计的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm值计算常见公式：在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃；在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃。另外还可以通过寻找文献推荐，调整引物序列，调整反应体系，调整酶种类，计算得到Tm值。对于进行PCR试验而言，最优的引物Tm值一般在55-65℃之间。
获得引物的Tm值只是寻找最适退火温度的起始，而梯度PCR则是寻找最佳退火温度最简便的方式。利用梯度PCR仪，通过现有的引物熔解温度(Tm)设置温度区间。将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃，以2℃为增量设置梯度温度筛选最适退火温度。
同样也可以通过瑞沃德梯度PCR仪自带的Ta值计算功能，将引物对的碱基序列直接输入，即可获得Ta值，将计算结果中的 Ta 值写入到步骤设置温度梯度界面的中值字段中，获得一组梯度温度进行最适退火温度筛选。

同花顺

具体没有定数，“退火温度要低于理论Tm值”只能说是常规操作、约定俗成，就算直接Tm值整数值跑也没问题，关键在于掌握Tm和退火温度、引物特异性之间关系：
      退火温度要低于理论Tm值，以使引物能够与可能的模板互补配对；
      同时，PCR仪退火温度设置还要可能足够高，以避免引物与模板间的非特异性扩增

综上，最佳的方法是采用“梯度（降落）PCR”，首先以引物Tm整数值为退火温度跑5~10个循环，然后以低于引物理论Tm值的温度【最低不低于引物理论Tm10℃，可采用Tm-5的温度跑】跑20~30个循环，以获得最佳PCR效果【既特异性强，又效率高、产物多】


至于上下游引物Tm值应选取两者中的最低温度作为两条引物的Tm，并进而进行后续程序设置。
一般引物Tm要在60，pcr退火参数温度在55，但也不必刻意强求。

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谢邀。题主的问题应该是想从cDNA里面克隆一个基因但是没有克隆出来，所以想从退火温度上找问题。首先如果是退火温度的话，题主在设计引物的时候就会得到自己的退火温度，我们一般设计在58℃左右，但是温度不是关键问题，主要需要让上下引物的退火温度不要相差太大，题主没有p出任何条带，所以降低退火温度的做法是正确的。但是对于没有克隆出这个基因还有几个问题需要考虑:1.应该选取待克隆的基因高表达的细胞系或者组织，没有克隆出来有可能是你的目的基因的含量本身就很低，所以要选高表达的细胞系，如果没有这类细胞系的话，选取相对较高的细胞系提出来的cDNA当模板，或者可以设计2对引物做巢式PCR，或者适当提高模板的量。 2.做退火温度梯度先试一下，如果做的不好可以直接用降落PCR，这个本身是为了纯化产物，但是也可以用于你这种情况。3.换更好的酶，或者更换大的PCR反应体系。

同花顺

一般是比订购引物的温度高5度，这样才会特异，如果太低的话会造成非特异性扩增的，但是一般用引物本身的温度也可以p出来的。

继续前进

有些是用引物的Tm值－5℃作为退火温度，其实也没必要完全按照这个公式来计算。退火温度跟酶和buffer有关，不同厂家可能不一样。
一般在实验过程中将退火温度设置在55－60℃之间就可以。
没有目的片段可以从以下几个方面考虑:
1. 含有PCR反应抑制物
对样本稀释(l: 100 和1:1000) 后再扩增，并通过在已知阳性模板中加入原始PCR 混合物进行扩增，验证抑制物的存在；
2. 模板浓度太低，扩增循环数不够
尽可能降低退火温度，在降落PCR 的最低温度增加10个扩增循环；
3. 非特异扩增
增加起始模板的变性温度(通常为95℃ 5min)，采用降落PCR和热启动PCR
4. 扩增反应混合液中各成分浓度不对
改变TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的浓度及缓冲液的pH
5. 原始模板浓度太低
使用巢式引物对第一次扩增产物进行稀释（l :100 和1:1000)后扩增；
6. 扩增需要增强剂
加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亚枫CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增强剂
7. 引物设计存在问题
重新设计引物