这个问题很头痛，你们怎么看核酸提取？

病理医师

最近拿到一份转基因的小麦 但是CTAB法DNA总也提不出来，第一次提出来的DNApcr也p不出来。已经排除试剂手法问题，想问下各位有什么高见么？

原文地址：https://www.zhihu.com/question/279731771

继续前进

植物科学是现代科学研究中一个十分重要的领域，而核酸的提取和纯化则是一项分子生物学研究的基础技术。因此，从植物中获得高质量的核酸，就成为了后期深入研究其各项性能指标及应用的前提。但是由于植物相较于其他科研模式生物来说有其独特性，所以在提取核酸的过程中也存在着不少的难关等着我们去一一破解。
古人云：“知己知彼，百战不殆。”因此想要从敌（植）人（物）手中获取重要的信（核）息（酸），就需要先来了解一下我们整个过程的方（基）针（本）策（原）略（则）。


植物样本提取的基本原则
1. 完整性：核酸无降解或降解程度较轻（保证核酸一级结构的完整性就保证了内含遗传信息的完整性）
2. 纯度：排除有机溶剂、金属离子、蛋白、多糖多酚、脂类、其他核酸等的污染和干扰
3. 操作简便
4. 实验结果稳定性强
定好大方向后，接下来我们就步入正题，跟上小V的步伐，我们一起来看看整个提取的过程以及我们需要注意些什么问题?又有哪些细节上的小问题被你不小心忽略了呢？




样本选择
1. 了解样本类型（核酸含量，酶、多糖多酚、脂类等特殊杂质的含量）选择合适的提取方法，如果是多糖多酚类植物，建议使用专门的提取试剂盒；
2. 如果植物组织表面污渍较多，在采集之前应迅速用预冷的纯净水或75%乙醇擦拭或冲洗干净，再用吸水纸吸干组织表面残留液体；
3. 在与研究目的不冲突的前提下，尽量选取新鲜、幼嫩、生长状态良好的组织部位（植物组织越幼嫩新鲜所含的次生代谢产物就越少，随着植物组织的逐渐成熟，次生代谢产物的含量会逐渐增多，而次生代谢产物的存在会影响核酸的提取效果，次生代谢产物越多，核酸提取越困难，得率也越低。）；   
4. 尽量选择细胞数量多、核酸含量丰富、次生代谢物少的部位。


样本保存
1. 建议样本现取现提，防止样本本身存在RNA降解；
2. 暂时不能提取的样本迅速置于液氮中冷冻1h以上，然后转移至-70℃长期保存，且在保存期间避免反复冻融；
3. 建议不要使用保护液保存植物组织（因植物组织含细胞壁及次生壁，保护液不易渗透进组织内部，达不到保护效果）。


样本前处理
1. 推荐使用液氮进行样本处理，同时保证研磨彻底，研磨至粉末状为止；
2. 样本量较多时，建议可以少量多次进行操作；
3. 样本投入量要适当，建议按照对应的说明书进行添加，防止样本裂解不完全；


核酸提取、纯化
01裂解样本


02提取方法


PS:在沉淀法中
使用异丙醇
优点：所需溶剂量相对较少；沉淀速度快。
缺点：易存在盐离子残留；沉淀过程中不易挥发。

使用无水乙醇
优点：不易存在盐离子残留；沉淀过程中易挥发
缺点：同时还需添加醋酸钠等试剂中和电荷帮助沉淀核酸。

共同点：都需要使用70%-75%乙醇清洗盐离子。
03不同杂质的纯化方法


04溶解核酸
DNA：弱碱性 TE Buffer（PH=8左右）
RNA：无RNase H2O
洗脱体积：尽可能将膜覆盖完全；可以提高溶解液体的温度提高溶解能力。




1. 浓度：紫外分光光度计、Qubit
2. 纯度：紫外分光光度计（DNA：OD260/280= 1.8-1.9  RNA：OD260/280=1.9-2.1）
琼脂糖凝胶电泳（DNA：明亮且单一的条带 RNA：清晰三条带，且最大条带亮度是第二条带亮度的两倍及以上）




1. 保存温度：-20℃/-70℃长期保存
2. 避免反复冻融，建议分装保存
3. 缓冲液：DNA片段较长建议使用TB/TE Buffer（弱碱性）

细节决定成败，想要获得好的结果，大家不妨对照以上内容仔细回想一下，在提取植物核酸的时候有没有什么遗漏的地方。如果能给小伙伴们提供哪怕一点点灵感，小V码再多字也是值得的。

不知道大家在植物核酸提取的时候，还遇到过哪些无法解决或感觉困惑的地方呢？在留言区跟小V分享一下，让我们一起交流，共同进步吧！

图片来源：千库网

清风寡欲

核酸提取看似简单，其实有很多门道，而且提取的质量直接关系到下游实验的成败。

这个需要知道题主想拿到DNA做什么实验，不同下游实验对DNA质量的要求也是不一样的。

暂且先认为只用于基因扩增使用。PCR扩增对DNA质量的要求是比较低的，所以可以有很多种选择来达到目的。由于涉及的方法实在太多，在这里就不一一列举了，就挑一个最简单易行的办法讲吧。

部位选择：就小麦而言，最好提的部位依次是嫩芽、嫩根、叶子、最后是种子。总之就是越嫩越好提，越老越难提。如果楼主只有种子，建议进行泡发，发芽后用芽进行提取。

方法选择：CTAB法虽然是经典的植物提取方法，但是其裂解能力是很差的，对于楼主的情况建议直接用研磨破壁+SDS法。这套方法的关键在于破壁，只有破掉细胞壁SDS才能发挥其功效，所以切记要充分研磨。此方法的优点在于，SDS拥有很强的裂解能力，可以获得较高的核酸产量，既然是转基因小麦，肯定是想要检测转基因的部分，所以较高的核酸产量可以保证转基因部分的模板量充足，便于后续的PCR扩增。

今天时间太晚了，只能简要解答，如果楼主后续还有什么问题可以私信我。

清风寡欲

pcr p不出来不一定是DNA没提出来，也可能是你引物设得不好；
植物核酸提取最为重要的是组织的破碎，建议先用石英砂或液氮充分研磨；

感恩由您

CTAB法提不出来还可以用SDS法啊，还有其他的方法。
还有材料的问题，一般选择幼嫩的叶子。话说，小麦也是研究的人很多的，应该有成熟的DNA提取方法，你提WT小麦的DNA是否也有问题呢？是否加β-巯基乙醇？
实在不行用试剂盒。

感恩由您

你提的时候可以带上普通的小麦，已知的转基因阳性并且能提出DNA的小麦当成阴性阳性对照

不行的话可以试剂盒啊

我觉得提不出来更有可能是你的试剂出问题而不是你的转基因小麦出问题