ImageJ实用技巧——荧光共定位分析原理(解析篇)

wolf

荧光共定位分析(colocalization)，是一种重要的荧光分析方法。
它的本质其实就是分析不同荧光标记的蛋白（这两种荧光必须有独立的发射波长），在空间中的重叠，从而判断这两种蛋白是否处于同一区域，即在同一像素上是否“恰巧”出现了两种不同的荧光分子。
共定位分析能间接地说明两个蛋白与同一结构有联系，但不是两种蛋白有相互作用的直接证据。荧光偏振能量转移（FRET）是研究蛋白质之间相互作用的一种比较直观的方法。

上一篇文章介绍了怎样利用ImageJ的插件进行荧光共定位：
但没有对具体的原理以及参数进行仔细的说明。这一篇会对荧光共定位的原理进行深入地解析，只有懂得了原理，才能避免在进行共定位分析的时候出现错误或者大的误差。
英语阅读不错的同学可以直接看官网说明以及Coloc 2的说明：

注：能打开下面视频的同学，请看完视频后，再看这篇文章。不能打开的，想办法。
参考视频：https://www.youtube.com/watch?v=QumGrxwajeE

一、两种荧光分子的共定位关系

如下图所示[1]，用绿色荧光和红色荧光分别标记两种蛋白，这两种荧光的定位关系可以分为以下4类：
1、位置重合且亮度相近（Complete）；
2、位置重合但亮度差别较大（Different intensity）；
3、部分重合（Partial）；
4、完全不重合（Exclusion）。


<hr/>二、共定位表征参数

共定位分析可以通过一系列不同的参数进行表征的，现在常用的两种参数是PCC和MCC[2]，其中MCC这一参数使用最为广泛。还有其他的一些参数例如Spearman, Kendal&#39;s Tau, Li&#39;s ICQ，在这里就不再赘述。
1、皮尔森相关系数——Pearson’s correlation coefficient (PCC)


PCC的取值在1到-1之间。1表示完美相关; -1表示完全负相关，零表示随机关系（蛋白A和蛋白B随机分布，无相关性）。

2、曼德斯共定位系数——Manders&#39;  Colocalization Coefficients (MCC)




这两个系数使用地最为广泛，因为M1、M2代表一种蛋白质与另一种蛋白质共定位的部分，占这种蛋白总量的比例。相当于确定了两种荧光分子的重叠比例。例如，公式中的M1表示和绿色荧光共定位的红色荧光部分占总红色荧光区域的比例。

三、PCC和MCC的优缺点对比

很多同学在进行共定位分析的时候，常常会发现某个参数的大小与肉眼观察到的共定位情况差别很大。这是因为每一个参数都有其适用条件和优缺点，不对图像进行合理的分析和处理，会得到错误的分析结果。
1、PCC的适用条件即优缺点
适用条件：荧光A、B同时出现时比例相近，含量有比例关系


PCC只对线性数据有很好的解释和准确性，比如A、B在不同地方同时出现时的比例相近，例如都是1:1，这时候PCC能准确描述。但如果A、B虽然同时出现，但是不同地方的A、B含量比例不同，则用得到PCC会不准确。且背景对PCC有较大影响，测量时需要框选ROI以去除背景的影响。
优点：PCC测量不需要对图片进行预处理，简单且不受用户偏差的影响，分析速度快。
缺点：PCC只适合两种荧光强度呈单一线性关系的情况进行共定位分析，对于没有固定比例分配的两种蛋白的共定位，PCC得到的结果较差。PCC只能得出一个抽象的整体值，不能反映共定位比例，且不适于表征3D图像的共定位。

2、MCC的适用条件即优缺点
适用条件：要求荧光信号有一定强度，能和背景很好地区分开。


优点：MCC最明显的优势在于它比PCC更直观地衡量共定位，能够显示荧光之间的重叠比例。对于PCC不能很好测量的非线性比例的情况，MCC也能很好表征。MCC分析也更适合于3D共定位分析。
缺点：MCC需要进行背景校正，检测前需要利用Threshold或者框选ROI以去除过多背景，因为背景对MCC的影响很大，需要对图片进行预处理。

四、共定位流程总结

如下图所示[2]，这一流程图总结了在进行共定位分析时注意事项，什么情况下选择PCC、什么情况下选择MCC。
虽然现在应用的系数大多是MCC，但是也要分析具体的情况，例如荧光是否呈线性比例、物体是否能与背景准确分割等。


不论是选择PCC还是MCC，都需要框选ROI，以减小背景对结果的影响！

五、共定位散点图（scatterplot）分析

下图是一个典型的共定位散点图[1]，x轴为绿色荧光的灰度值，y轴为红色荧光的灰度值。散点图上的每一个点，都代表图像上一个像素点红色和绿色强度的值。


Basal noise区域靠近原点，代表暗的背景。如果两种颜色的荧光呈1:1的共定位关系，则会看到一条斜率为1的趋势线：


如果两种颜色的荧光呈一定比例的共定位关系，但一种颜色将比另一种颜色更暗，会导致趋势线的斜率更倾向于该轴，例如下图：


如果两种颜色的荧光无明显的共定位关系，则出现的散点图如下所示：


<hr/>如果对于ImageJ使用有什么问题可以私信我，或者给我发邮件：zhaoyc9@163.com
更多教程可以关注我的专栏：
希望对大家有帮助~

参考文献：
[1]. Bolte S , F. P. CORDELIèRES. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy[J]. Journal of Microscopy (Oxford), 2006, 224(3):213-232.
[2]. Dunn K W , Kamocka M M , Mcdonald J H . A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy[J]. AJP: Cell Physiology, 2011, 300(4):C723-C742.
[3]. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images[J]. Journal of Microscopy, 1993, 169(3):375-382.


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