染色体荧光原位杂交实验过程各试剂的用途及原理？

营养师

染色体荧光原位杂交总是杂不上信号点，或者只能是一个，其原因可能有哪些呢？
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检验医师

不同标本实验条件不一样，能说一下你们是临床检测还是课题实验需要吗？什么样的标本，石蜡切片，血液，尿液？

清风寡欲

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什么是荧光原位杂交
荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）出现于20世纪70年代末，是一种非放射性原位杂交技术。它根据碱基互补配对原则，通过特殊手段使带有荧光物质的探针与目标DNA结合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。对目标DNA进行定性、定量或相对定位分析。


荧光原位杂交具有那些优点：
1.FISH不需要放射性同位素标记，更经济安全。
2.FISH探针稳定性高，特异性好。
3.FISH通过多次免疫化学反应，使杂交信号增强，灵敏度提高，其灵敏度与放射性探针相当。
4.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列。
荧光原位杂交应用在哪些方面
FISH被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌，宫颈癌，肺癌和淋巴瘤等实体肿瘤的靶向治疗和辅助诊断。
FISH在基因定性、定量，整合、表达等方面的研究中颇具优势，目前已经被广泛应用于遗传病诊断、病毒感染分析、产前诊断、肿瘤遗传学和基因组研究等许多领域，在临床检验、教学和研究等方面扮演着重要的角色。
荧光原位杂交技术流程有哪些?
技术路线：


详细实验流程:
一）标本类型
1、遗传病：外周血、羊水、绒毛、胎儿脐带血制备的染色体，或羊水和绒毛的间期细胞。
2、血液病：外周血或骨髓的染色体或间期细胞。
3、实体肿瘤（包括骨髓活检）：理论上讲，任何含有足够癌细胞或DNA的组织、细胞或体液（如胸水、腹水等）标本都可进行相应的基因状态检测，但必须依据相应现行的临床诊治指南来选择。
二）标本固定
1、遗传病和血液病（除石蜡包埋骨髓活检标本外）：染色体或细胞制片后，50～60℃烤片2小时。
2、细胞学标本：细针穿刺标本，取样后应立即95%乙醇固定；胸、腹水标本取样后，优先建议沉渣包埋制备细胞蜡块，离心后，95%乙醇或3.7%中性缓冲甲醛液固定；对于细胞量过少或不具备制备蜡块条件的实验室，取样涂片后立即95%乙醇固定。
3、组织学标本：组织离体后尽可能在30～60分钟内将组织按规范剖开，置于不少于自身体积4～10倍的3.7%中性缓冲甲醛固定液（pH7.2～7.4）中固定6～72小时【1-4】。固定液的pH值会直接影响蛋白及核酸的含量【1,2】。组织学标本过度固定或固定不足都会导致检测结果的变化。
三）标本脱钙
骨组织及钙化病灶固定后，需要先将钙盐除去使组织软化，以便于后续的临床检测。传统的脱钙剂（盐酸）会显著降解DNA和RNA，无法保证荧光原位杂交检测结果的准确性，脱钙剂乙二胺四乙酸（EDTA）可以在脱钙过程中保护DNA，但脱钙时间会延长至48小时【5,6】。
四）组织脱水、透明、浸蜡
实验室需根据自身的实际情况，通过严格的测试，制定标准化的组织脱水、透明、浸蜡流程以及试剂更换程序。建议使用自动组织脱水机和梯度乙醇脱水方案，如70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇×2→无水乙醇×2。根据处理的组织类型和大小以及脱水机的工作效率，每种梯度的乙醇作用时间可设定为60～120分钟。根据处理组织的数量和试剂使用时间及时进行更换，脱水时间不足或试剂更换不及时均会导致后续染色、杂交效果不佳。
五）组织切片
根据检测要求石蜡切片厚度为3～5μm，贴于阳离子或正电荷（或类似的）等专用防脱载玻片上，确保切片与载玻片间没有气泡。切片在空气中略微干燥后应立即烤片，推荐标准温度为65℃烤片不少于2小时。荧光原位杂交未染色的切片置于室温不宜超过6周【3,7】。
二、荧光原位杂交检测步骤
荧光原位杂交检测根据检测标本的不同，操作步骤略有差异，主要流程包括：预处理、变性/杂交、杂交后清洗等环节。荧光原位杂交新项目开展之前，应进行包括方法学及试剂等性能验证，建立符合实验室的标准化操作流程，以确保结果的准确性。
一）脱蜡
烤好的组织切片需经过脱蜡处理，二甲苯脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交效率降低、荧光背景高等，影响实验结果。因此脱蜡使用的二甲苯必须及时更换，通常至少每两周更换一次，并可根据实际情况延长脱蜡时间；脱蜡过程中产生的有机废物需进行回收处理【8-10】。
二）预处理/酶消化
1、切片预处理：在现阶段，预处理常见试剂有1mol/L硫氰酸钠、30%酸性亚硫酸钠、10mmol/L柠檬酸、去离子水等；处理方法有高温水浴、高温高压等；预处理温度50～120℃不等。处理程序会因组织类型不同而有差异。
2、酶消化处理：对切片进行酶消化，常用的蛋白水解酶有胃蛋白酶和蛋白酶K。不同批号、不同厂商的胃蛋白酶活性不同，消化能力也存在一定的差异。酶消化的作用是分解包围靶DNA的蛋白质，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。酶消化注意事项：①酶的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高，会对细胞的结构有一定的破坏，细胞核消失或细胞核辨认不清，也会造成一定程度的组织脱片；②酶消化不足会造成蛋白消化不透彻，降低组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率；③消化酶均为现用现配，且工作液使用时间<24小时【11-13】。
3、梯度乙醇脱水：将组织切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2分钟脱水，自然晾干。注意事项：切片必须充分脱水晾干，避免造成信号减弱或者杂交失败。
三）探针的应用
1、探针的配制：内常用的探针有即用型和非即用型，即用型探针可直接点样杂交，操作简便。非即用型探针是需要操作者将探针与杂交缓冲液按一定比例配制，配制方法参照探针厂商说明书。注意事项：①探针不宜反复冻融，可适当分装；②震荡旋涡时需轻柔；③充分混匀，如果混匀不均，会导致杂交信号微弱或无信号【3,8,9】。
2、探针的加样：参照选用厂商推荐或经过本实验室有效性验证纳入标准化操作流程文件的探针加样量，加到待杂交组织中央处，使用合适的盖玻片，橡胶水泥密封四边。注意事项：①探针的使用和配制遵照本单位选用试剂的产品说明书操作；②盖玻片一般采用硅化盖玻片或无菌的蜡膜；③注意环境光强度，避免太阳光或强烈的光照；④加盖玻片时注意不要留有气泡，避免因气泡造成干片现象，导致无杂交信号或杂交率降低；⑤盖玻片边缘封胶不严密也会出现干片现象。
3、变性及杂交：变性和杂交分为甲酰胺变性杂交（手工操作）和杂交仪变性杂交（自动操作）。前者是将组织切片和探针分开进行变性，后者是在杂交仪中对组织切片和探针共变性，此方法可以在一定程度上降低人为因素的影响。根据所选用厂家探针的要求，设定共变性杂交条件，可选变性温度和时间：72～95℃，3～5分钟，杂交温度和时间：37或42℃，16～18小时。注意事项：为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失及防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。
4、杂交后处理：杂交后处理的目的：①洗去多余的未结合的探针；②洗去非特异度结合的探针片段，有效降低杂交背景。杂交后洗涤一般遵循的共同原则：盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。可选择的洗液有0.3%NP-40/2×SSC溶液、0.1%NP-40/2×SSC溶液、50%甲酰胺/2×SSC等，具体请参照相应厂家的试剂说明书。注意事项：①在漂洗的过程中，切勿使切片干燥；②影响洗涤的因素有：洗液中NP-40的浓度、洗涤时间、洗涤温度、洗液pH值【10,13-15】。
5、对比染色、封片：在杂交区域位置滴加足够量的DAPI复染剂，立即盖上盖玻片，-20℃冰箱内存放。注意事项：①4,6-二咪基-2-联苯基吲哚（DAPI）是一种毒性物质与致癌物，操作过程中应注意个人防护措施。如不慎接触，立即大量水冲洗【11,13】。②注意避光，紫外线会造成荧光淬灭。③宜选用较大盖玻片或是选用指甲油在盖玻片四周封片。可以有效避免阅片时镜油的渗入对信号观察的影响。荧光原位杂交结果应立即照相存档并将切片置于-20℃保存，建议至少保存3个月备查，有条件的可以保存1年以上，仍可见清晰信号。
三 读片
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（1）材料培养：营养液、成分试剂、培养基、培养液………
（2）分子实验： (蛋白实验、核酸实验) (核酸提取[DNA、RNA、质粒]、蛋白提取、纯化、定量、重组表达、载体构建、测序合成、电泳、染色、转膜、WB杂交、互作、基因功能研究……)
（3）细胞实验：显微观察、染色、固定、细胞层面的蛋白实验………
（4）生理实验：神经、血细胞、呼吸、营养、代谢、激素、色素………
（5）生化实验：生化反应、酶活、免疫、电解质、（核酸实验、蛋白实验）………
（6）生态：检测、遥感、宏观统计、进化关系………
（7）生物信息……