细胞免疫荧光染色

千姿百态

1. 目的
免疫荧光染色细胞的检测方法和操作步骤。
2. 范围
适用于鉴定细胞的免疫荧光检测的实验方法。
3. 责任
3.1 操作人负责按本规程的要求及步骤进行操作维护。
3.2 QA及项目负责人负责监督确保操作人员的操作维护遵循本规程。
4. 材料和仪器




4.3 其他
4.3.1 已有配备溶液



5. 实验过程 (48孔板为例)
5.1细胞种植：将细胞消化后按照所需浓度种植于48孔板，置于37°C二氧化碳培养箱培养过夜。
5.2固定：取出48孔板，弃去培养基，每孔加入PBS 500μl，静置5min，吸走液体，每孔加入200μl 的4%多聚甲醛固定液，室温固定30min。
5.3洗涤：每孔加入PBS 500μl，静置5min，吸走液体，重复3次。
5.4通透：每孔加入200μl 的0.1% Triton x-100，室温静置15min。（膜表达的蛋白鉴定建议不通透，具体参考抗体说明书）
5.5洗涤：每孔加入PBS 500μl，静置5min，吸走液体，重复3次。
5.6封闭：每孔加入500μl 5%牛血清封闭液，37℃孵育2h或者置于冷藏冰箱中过夜，弃去液体。
5.7一抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀释的抗体（稀释比例参考抗体说明书），37°C静置2h或者4℃过夜。
5.8洗涤：PBST每孔500μl，静置5min，吸走板中液体，重复3次。
5.9封闭：每孔加入200μl 5%牛血清封闭液，室温封闭15min。（本底高的可以加这一步）
5.10二抗：每孔加入200μl采用2%牛血清稀释的二抗（种属和一抗的要对应，举例：一抗是来源是兔抗X，二抗就用Y 抗兔-荧光，稀释比例参考抗体说明书），37℃避光孵育1h。
5.11洗涤：PBST每孔500μl，静置5min，吸走板中液体，重复3次。
5.12染核：Hoechst 浓度2μg/ml，每孔200 μl，室温避光染色15min。
5.13洗涤：PBST每孔500μl，静置5min，吸走板中液体，重复3次。
5.14拍照：洗涤完毕每孔加入200μl PBS,将细胞置于显微镜下观察，选择所需倍数，拍照保存。
文章来自：无锡菩禾生物医药技术有限公司


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