体外诊断试剂方法学原理之——竞争法

莺歌燕舞

什么是体外诊断试剂？
按《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》所定义：体外诊断试剂是指按医疗器械管理的体外诊断试剂，包括可单独使用或与仪器、器具、设备或系统组合使用，在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中，用于对人体样本（各种体液、细胞、组织样本等）进行体外检测的试剂、试剂盒、校准品（物）、质控品（物）等。通俗的说就是用来测试人体样本（血液、尿液、唾液、组织等）的试剂。
目前市面上常见的体外诊断试剂项目超过500个，按检验原理可大致分为免疫、生化、基因测序三大类。其中免疫试剂所占的市场份额最多，近十几年来一直保持着高增速，受到的关注自然也最多。
免疫试剂有哪些常见的方法学？
免疫试剂无论是酶免、比浊、荧光、化学发光、电化学发光，还是一些小众的检测技术，其核心原理都是基于抗原——抗体反应。而受限于抗原——抗体反应反应特性，免疫试剂的方法学可大致分为：夹心法、间接法、竞争法。本文将详细介绍竞争法的基本原理。
竞争法的来源
利用竞争法制造试剂，从研发和生产的难度、到对配套仪器设备的要求，都远比基于其它方法学的试剂高。制造竞争法的试剂有诸多不利因素，为什么不用其它方法替代呢？答案是迫不得已。总所周知，一般的蛋白质，如HCG，由于其体积足够大，所以有足够的空间供2个不同的抗体去同时识别它，即把它如三明治般的“夹住”。但是对于一些小分子化合物，如孕酮，体积太小，一个抗体就能完全将其“挟持”而完全不留下多余的空间供另一个抗体去识别它。所以是完全用不上夹心法来检测到它。
竞争法的原理（图）
本文将以目前市面上常见的磁微粒化学发光法中的总甲状腺素（Total T4）来介绍竞争法基本原理。
首先，将包含T4的样本、包被了羊抗鼠的磁珠、连接着碱性磷酸酶的T4以及T4的鼠抗混合在一起孵育（包被了羊抗鼠的磁珠也可单独先与T4的鼠抗混合）。经过一段时间后，溶液中便会形成磁珠-羊抗鼠抗体-T4，或者磁珠-羊抗鼠抗体-连接着碱性磷酸酶的T4的两者中至少一种。



含T4的样本、包被了羊抗鼠的磁珠、连接着碱性磷酸酶的T4以及T4的鼠抗混合



溶液中形成磁珠-羊抗鼠抗体-T4、磁珠-羊抗鼠抗体-连接着碱性磷酸酶的T4

上述混合物经过磁分离清洗后，未结合到磁珠上的所有其它物质都被洗掉了。加入底物液后激发，便可以测到发光信号了。如下图所示。



碱性磷酸酶激发后发光，测试信号

整个过程可以看做是样本中的T4与连接着碱性磷酸酶的T4竞争的结合T4的鼠抗。由于连接着碱性磷酸酶的T4的量是固定的，所以样本中的T4多少，直接影响到连接着碱性磷酸酶的T4与T4的鼠抗的结合量，从而影响到光信号的值。
样本中T4越多，竞争则越强，连接着碱性磷酸酶的T4结合到磁珠的量就越少，则最后的发光信号就越弱，反之样本中T4越少，最后的发光信号就越强。光信号的强度与样本中的T4量呈负相关。所以整个系统通过校准后，就可以通过检测光信号的强弱计算出样本中的T4浓度了。

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