临床检验微生物实验室工作流程（细菌检验）

空白派

写一份检验科微生物实验室的工作流程给医学检验技术专业的同学们参考。
为什么我要写微生物检验？
首先，微生物学检验是一个连续的过程，从标本的接种到最后的药物敏感实验连成一体的。而其他小科室的检验是独立的。
其次，我自己的实习经历中，微生物是最让我感到迷糊的。很多时候都不知道自己在做什么，为什么要这样做？
以上就是两点浅谈的理由，接下来进入正题，一起走进微生物检验。
一、标本的采集与种类（含一般检验流程）
基本原则（虽然检验人员不用负责标本的采集，但一些基本原则应该掌握)
1.尽量病程早期、症状典型以及在使用抗生素以前采集。
2.标本应使用无菌容器盛放。
常见的微生物检验标本种类
1.血液：血液为无菌液体，因此在采集时要避免皮肤的正常菌群污染。多采用血培养瓶运送，随后放入血培养系统自动培养。如有报阳则进行下一步检验：涂片镜检报给临床初步结果；需氧和厌氧瓶分别转种血平板，巧克力平板与厌氧血平板等；随后进行菌种鉴定以及药敏试验。
2.脑脊液：脑脊液标本一般需要进行离心，是为了富集。一般检验流程为进行涂片镜检，包括革兰染色，抗酸染色与墨汁染色等。增菌管进行增菌，分离培养转至血平板，巧克力平板，沙保弱平板等。
3.痰液：痰液镜检一般包括革兰染色与抗酸染色，分离培养多用巧克力平板和血平板。
4.尿液：尿液常做定量检测，取10微升尿液进行连续划线。
5.粪便：常用革兰染色做菌群比检测；分离培养多用麦康凯与SS平板。



各类微生物标本应通过传递窗进行传递。

二、标本的接种与染色镜检
一般标本完成之后，就可以进行接种与涂片镜检操作。  
1.常用接种方法：
连续划线法：用于分离杂菌不多的标本，例如尿液。
分区划线法：最常用的方法，大多数标本的分离方法。
棋盘划线法：用于杂菌多的标本分离，例如粪便。
涂布接种法：常用于纸片药敏测定中。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          
2.常用接种的培养基 （大家在平时的接种操作中可以多观察不同的标本用的都是什么培养基？又是为什么？）
血平板：适合各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离都应接种血平板。同时血平板还有一个非常重要的作用——观察溶血反应。
巧克力平板（不加抗生素）：有V、X因子，适于接种疑有嗜血杆菌和奈瑟菌的标本。淋病奈瑟氏菌可形成灰白或粘液样的小菌落。流感嗜血杆菌形成潮湿的珍珠样小菌落（直径约1mm），具有鼠臭。α-溶血的链球菌形成草绿色溶血环。巧克力平板为非选择性培养基，大多数非苛养菌都可生长。
巧克力平板（加抗生素）：与普通巧克力不同的是，它加入了杆菌肽。可抑制多数细菌的生长，用于筛选嗜血杆菌。
麦康凯平板：其中的胆盐可以抑制革兰阳性细菌的生长,而对伤寒等沙门菌有促进生长的作用。同时也是非发酵菌鉴定的重要依据，沙门菌及志贺菌呈无色菌落,大肠埃希菌呈桃红色菌落。
SS平板：SS琼脂为强选择性培养基，用于志贺菌和沙门菌的分离。
营养肉汤：用于各类细菌的增菌。
血液培养基：一般用于全血的培养，也可用于骨髓以及其他分泌物培养。（采用全自动血培养仪）



标本接种应在生物安全柜进行。

3.培养方法
需氧培养法：用于需氧和兼性厌氧菌，35℃，18-24小时，一般细菌可生长良好。
二氧化碳培养法：流感嗜血杆菌，奈瑟菌等需要在5%-10%的二氧化碳培养箱中才能良好生长。
厌氧培养法：适用于兼性厌氧和专性厌氧菌。常用的有厌氧罐法，气袋法和厌氧手套箱法。



微生物室常用孵箱，35℃与28℃，分别用于普通细菌和真菌培养。



全自动血液培养仪

4.常用染色方法
革兰染色：是最常用的方法，阴性菌呈现红色，阳性菌为紫色。（原理：革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，加上它基本不含类脂，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在细胞壁内，使其呈现紫色。而革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大缝隙，复合物容易溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞又成无色。这时再用红色染料进行复染，革兰氏阴性细菌将获得一层新的颜色--红色，而革兰氏阳性菌则仍呈紫色。）
抗酸染色：用于抗酸杆菌的查找，例如结核分枝杆菌。（原理：分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。）
特殊染色：包括荚膜染色，芽孢染色等。



革兰染色仪器

三、培养
接种完成之后，根据不同的检验目的分别放于不同的培养箱，常用的培养方法即以上提到的三种。有一些实验室只有一个细菌培养箱，同样放入即可。
四、细菌的生长现象（此处仅指固体平板）
培养完成后，应当及时观察细菌的生长现象，为后面的检验打下基础。

• 菌落的表面特征：光滑型菌落（S 型），粗糙型菌落（R型），黏液型菌落（M型）。
  
• 血平板溶血现象：α溶血（草绿色部分溶血的不完全透明的溶血环）；β溶血（清晰透明的溶血环）；γ溶血（无溶血环）；双环（完全溶血外还有一个部分溶血圈）。
  
• 气味：铜绿（生姜味）；厌氧梭菌（腐败恶臭味）。
  

五、细菌鉴定与药敏
目前医院的细菌鉴定主要是两套仪器。
1.质谱仪：质谱仪的鉴定原理为细菌蛋白图谱，具有快速，准确等优点，为后续的药敏试验提供更加精确地指导。但质谱仪价格昂贵，许多医院未配备。
2.全自动微生物鉴定和药敏系统：该系统需要事先人为区分细菌属于革兰阴性菌还是革兰阳性菌（不确定的应当先进性革兰染色），再用相应的细菌鉴定卡鉴定同时进行药敏试验。
个人认为药敏试验是极为复杂的一个环节，还有E-test试验，手工药敏等，只能浅谈之，欢迎补充！



常用的vitek全自动微生物鉴定和药敏系统

六、保存菌种
菌种保存可用于临床质控、教学和科研。
文章有不对、不足之处，请大家批评指正！

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