通过改善PCR条件应对“难扩增”的目的产物

生物科研实验室

我们应该看PCR的说明书的哪些重要部分？

1. 产品描述

热启动: 抑制非特异性扩增。
长度：不同的酶扩增目的片段的长度有限，否则扩不出来或者保真性差。
3'→5'外切酶活性：具有校对功能，保真性强；taq酶不具有此功能。
末端：扩增产物的末端是否有A，是下一步连接不上的主要原因。
2. 反应体系

不是越多越好！！按照说明书添加

酶：浓度过高会出现非特异性扩增

NTP：浓度过高会引起错配
3. 模板的纯度和使用量

① 模板的纯度

模板不纯时的蛋白质和脂类会抑制PCR反应，并且盐会影响酶活。

② 模板的使用量

不是越多越好！！按照说明书添加

过高：1）出现非特异性扩增；2）扩增不出来，原因是越多的模板，就会出现杂质抑制PCR酶活。
4. PCR程序

① 预变性：解开DNA双链，特别是高GC含量模板，建议添加；例如说明书建议：

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② 变性：按说明书，不做更改

③ 退火温度: 按标准程序未成功，按照结果进行改进
1）有目的条带，但有非特异性条带：提高退火温度，例如说明书建议：

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2）没有目的条带：降低退火温度，例如说明书建议：

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④ 退火时间：按标准程序未成功，按照结果进行改进