微流体用于核酸富集、分离和无PCR检测中的二氧化硅纳米结构

微流控芯片

高效的病原体富集和核酸分离对于准确、灵敏地诊断传染病，尤其是病原体水平低的传染病至关重要。我们的研究引入了一种双孔二氧化硅纳米膜嵌入的样品制备芯片，用于病原体和核酸富集/分离。该芯片具有独特的双孔纳米结构，包括大孔层和小孔层。计算模拟证实，这些纳米结构增强了表面积并促进了纳米涡旋的形成，从而提高了捕获效率。值得注意的是，与用于核酸检测的传统方法相比，该芯片的检测限降低了 100 倍。使用患者样本的临床验证证实了该芯片与发光共振能量转移测定相结合时具有卓越的灵敏度。该芯片的样品制备效率不断提高，双孔纳米结构的合成简单明了，为核酸的无聚合物链式反应检测提供了有前途的解决方案。

核酸 （NA） 可作为诊断生物标志物，准确、灵敏地诊断各种疾病，包括癌症、遗传性疾病和传染病。特别是在传染病中，分子诊断，如基于聚合酶链反应（PCR）的检测，是早期诊断的理想选择，因为与症状出现后较慢的抗体反应相比，病毒基因组的快速和大量积累。然而，在无症状或症状前期间，病原体的低浓度给检测带来了挑战，无需进行样本制备，例如病原体和核酸富集/分离。

商业NA提取方法主要依赖于表面结合，其中NA粘附在色谱柱、磁珠或微流体通道的固体表面上。然而，离心柱或基于微球的平台很费力，而且样品量有限。相反，微流控系统处理更大的样品体积，并有效地将目标分子（如细胞、细菌、病毒和 NA）输送到表面。然而，在考虑关键的液固界面时，由于结合位点受限和防滑边界条件，具有光滑和平坦表面的微流控芯片在提高结合效率方面表现出局限性。

解决这个问题的一种代表性方法是实施微混合器，以促进对流向地表的传质。虽然微混合有助于将目标输送到更靠近表面的位置并缩短必要的扩散长度，但它仍然受到防滑边界条件的限制。更直接的方法是增加表面积，并通过三维（3D）多孔结构滑动流动。纳米制造技术，如图案化、光刻和激光打印，已被用于创建这些多孔结构，但这些技术密集型、高度复杂且耗时，限制了它们满足对微流控系统作为样品制备芯片日益增长的需求的能力。例如，Zhang等人开发了一种用于外泌体检测的3D纳米图案微流控芯片。该芯片的纳米多孔域增加了表面积，促进了排水流动，并降低了表面附近的流体动力阻力，提高了捕获效率。然而，由于芯片尺寸小（从微米到厘米不等），纳米多孔域占总通道高度的 30-70%，因此芯片的吞吐量有限。因此，需要额外的样品制备过程，如超速离心来分离和浓缩样品。

我们介绍了一种简单、经济高效的大规模样品制备芯片制造方法，该芯片使用两片聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 薄膜和刻有微通道的双面胶带组装而成。该芯片包含薄而均匀的纳米结构，具有小孔和大孔，称为双孔二氧化硅纳米膜 （BSNF）。在计算模拟和颗粒接近测试中，这些独特的纳米结构显著增强了表面积和表面滑移流，同时在每个纳米孔中诱导了纳米涡旋，改善了病原体和NA的富集/分离。通过将 BSNFs 嵌入式样品制备芯片 （BSNFs-chip） 整合到基于 PCR 的检测中，与使用传统方法获得的 LOD 相比，我们的检测限（LOD）降低了100倍。此外，将来自 BSNFs 芯片的富集样品与发光共振能量转移 （LRET） 测定相结合，证明了其在临床样本中快速灵敏地检测严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2（SARS-CoV-2）RNA 的潜力。

结果

BSNFs芯片的工作原理、设计和制造

图 1 说明了制备用于病原体和 NA 富集/分离的 BSNF 芯片所涉及的工作流程。BSNFs是在大型商业PET薄膜（10 cm×7 cm）上合成的，作为样品制备芯片的顶部和底部基板。两层BSNF示意图合成分为四个步骤：（i）合成具有小孔隙的初始二氧化硅层;（ii） 去除胶束模板;（iii）合成具有大孔隙的后续二氧化硅层;（iv）去除胶束模板。胶束组分之间的pH依赖性相互作用影响胶束聚集，导至多孔二氧化硅纳米膜（PSNF）中形成小孔隙，在BSNF中形成大孔隙（补充图1）。BSNFs芯片是通过将两片BSNF合成的PET薄膜与微通道雕刻的双面胶带连接起来组装而成的。BSNF在微流控通道内的表面被3-氨丙基（二乙氧基）甲基硅烷（APDMS）官能化，以促进病原体和NA的结合。随后，BSNF芯片加载临床样品和己二酸二酰肼（ADH）作为交联剂。BSNF （BSNF-NH2） 的胺官能化表面通过静电偶联和与 ADH 交联的共价结合捕获病原体和 NA。最后，通过将洗脱缓冲液引入微通道来获得浓缩样品。

我们利用扫描电子显微镜（SEM）表征了扁平硅片和PET薄膜衬底上的双孔纳米结构（图2a）。俯视图 SEM 图像和 Feret 直径分布的直方图显示，第一层 PSNF34 是一种高度均匀的薄膜，平均 Feret 直径为 ~59.45 nm（图 2b）。在第二层合成过程中，通过胶束聚集和二氧化硅生长形成了两层BSNF。BSNF第二层的平均雪蕴直径为~230.9 nm，大于PSNF第一层的平均直径。BSNF 的小角 X 射线散射 （SAXS） 剖面在 ~0.45 nm−1 处显示散射峰，表明 PSNF 的存在，而强度的降低归因于较大孔隙距离的增加。BSNF的横视图SEM图像显示总高度为~400 nm，第一层和第二层之间有明显的边界（图2c）。两个 BSNF（顶层和底层）在微通道内的总高度约为 800 nm。值得注意的是，BSNF代表薄涂层，仅占300μm总微通道高度的0.27%。

开发了模拟真实孔隙的虚拟模型来研究纳米结构的表面积（图2d-f）。与平坦表面相比，PSNF的模拟表面积显著增加了1244%，而BSNF的模拟表面积增加了1863%（图2g）。图2h显示了在大面积透明PET薄膜上合成的BSNF的照片，图2i显示了用BSNF制造的BSNF芯片的图片。我们通过注入带负电的量子点 （QD） 评估了带正电表面的 BSNF 芯片的捕获效率（补充图 7）。PSNFs嵌入式样品制备芯片（PSNFs-chip）的平均荧光强度与现有的平面样品制备芯片（Flat-chip）相比具有更高的值，而BSNFs芯片表现出比PSNFs芯片更大的强度，从而表明其具有优越的捕获能力。这些结果证实，与裸露的PET薄膜的平坦表面相比，PSNF和BSNF的表面积增加是由于纳米结构造成的。

我们对三个虚拟模型进行了数值模拟，以仔细检查流体流动并评估 BSNF 芯片的增强传质。这种增强是通过（i）消除纳米结构上的防滑条件来实现的;（ii）在纳米结构内产生涡流（图3）。正如直观地预期的那样，多孔结构的引入促进了纳米结构上和内部的流体流动。然而，裸PET的防滑底部没有流动。由于PSNF和BSNF模型中的切向滑移流，每个孔隙中都形成了纳米级涡流。这些涡流驱动流体流向纳米结构，从而增强了来自块状流体的质量传递和颗粒-表面碰撞的频率（即结合效率）。

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